Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.
Abstract
Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.
Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.
Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.
Introduction
Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren 1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt4. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration und Synaptogenese während der Entwicklung reguliert 5,6. Daher ist es dringend erforderlich, zuverlässige Modelle zu etablieren, die die fehlende vaskuläre Signalübertragung und Struktur für Gehirnorganoide liefern können, was die Komplexität der Generation menschlicher Gehirnorganoideerhöht 7.
Unter den vorgeschlagenen Methoden zur Vaskularisierung können zwei Hauptstromlinien in Betracht gezogen werden: die Organoid-Transplantation in einen lebenden Organismus und reine In-vitro-Technologien zur Kokultivierung von Endothelzellen und Nervenzellen 8,9,10,11,12. Die intrazerebrale Transplantation bei Mäusen ist kostspielig und zeitaufwändig, so dass andere Technologien für einfachere Modelle relevant sind. Der Chick Chorioallantoic Membran (CAM)-Assay wurde ausgiebig zur Untersuchung der Angiogeneseverwendet 13,14,15. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Gruppen erfolgreich verschiedene Arten von Organoiden, darunter Nieren16,17, Herz18 und Tumororganoide19,20, in CAMs transplantiert. Dennoch ist wenig über die Wirksamkeit, Toxizität/Abstoßung, physiologische Wirkung und Methoden zur Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die CAM bekannt. Ein weiterer interessanter und noch unerforschter Aspekt ist die Bildung einer chimären Blut-Hirn-Schranke (BHS) zwischen der CAM und der organoiden astrozytischen Grenzfläche. Frühere Pionierarbeiten deuteten auf die mutmaßliche Machbarkeit der Erzeugung einer BHS in der CAM durch Transplantation von Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Mediumhin 21,22,23. Reife Astrozyten scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, dies zu erreichen24,25. Daher bleibt die Astrozyten-induzierte Bildung der BHS umstritten, und die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide würde es uns ermöglichen, Licht in diese Kontroverse zu bringen.
Dieser Videoartikel beschreibt ein Protokoll für eine In-Ovo-Organoidtransplantation des menschlichen Gehirns in CAM, die Wachstum, Verbesserung und Vaskularisierung fördert und zu Organoiden führt, die histologisch kompatible BHS-Elemente umfassen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das Überleben des Hühnerembryos sicherstellt, und berichten über die Permissivität der CAM zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Gehirnorganoiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überpr?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Alcántara und Dr. Ortega von der UB und den übrigen Mitgliedern in Dr. Acostas Labor für die aufschlussreichen Diskussionen. S.A. ist Serra-Hunter-Assistenzprofessor an der Generalitat de Catalunya an der Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Riferimenti
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