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Biologia

Fabrication de grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65702
, , ,
1Department of Structural and Computational Biology,Scripps Research

Summary

Ici, nous décrivons un protocole pour l’application d’une seule monocouche de graphène sur des grilles de microscopie électronique et comment les préparer pour une utilisation dans la détermination de la structure cryoEM.

Abstract

La microscopie électronique cryogénique (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour sonder la structure atomique des complexes macromoléculaires. La préparation des échantillons pour la cryoEM nécessite la conservation des échantillons dans une fine couche de glace vitreuse, généralement suspendue dans les trous d’un film de support fenêtré. Cependant, toutes les approches de préparation d’échantillons couramment utilisées pour les études cryoEM exposent l’échantillon à l’interface air-eau, introduisant un fort effet hydrophobe sur l’échantillon qui entraîne souvent une dénaturation, une agrégation et une dissociation complexe. De plus, les interactions hydrophobes privilégiées entre les régions de l’échantillon et l’interface air-eau ont un impact sur les orientations adoptées par les macromolécules, ce qui donne lieu à des reconstructions 3D avec une résolution directionnelle anisotrope.

Il a été démontré que l’adsorption d’échantillons cryoEM sur une monocouche de graphène aide à atténuer les interactions avec l’interface air-eau tout en minimisant l’introduction de bruit de fond. Les supports en graphène offrent également l’avantage de réduire considérablement la concentration requise de protéines requises pour l’imagerie cryoEM. Malgré les avantages de ces supports, les grilles revêtues de graphène ne sont pas largement utilisées par la communauté cryoEM en raison du coût prohibitif des options commerciales et des défis associés à la production interne à grande échelle. Cet article décrit une méthode efficace pour préparer des lots de grilles cryoEM qui ont une couverture presque complète de graphène monocouche.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique monopartite (cryoEM) est une technologie de plus en plus utilisée pour étudier les structures 3D des biomacromolécules. Les progrès technologiques réalisés au cours de la dernière décennie dans le domaine de l’optique du microscope électronique, de la détection directe d’électrons1 et des algorithmes informatiques 2,3,4 ont permis aux utilisateurs de cryoEM de déterminer les structures de complexes macromoléculaires biochimiquement stables avec une résolution proche de l’atome 5,6,7,8 . Malgré ces avancées, il subsiste des obstacles notables à la préservation des échantillons pour l’imagerie cryoEM, ce qui empêche la majorité des échantillons biologiques d’être résolus à des résolutions aussi élevées.

La préparation d’échantillons pour l’analyse cryoEM à haute résolution consiste à piéger des macromolécules qui sont uniformément réparties dans une large gamme d’orientations dans une fine couche de glace vitrifiée. Les méthodes de congélation « blot and plunge » sont les méthodes les plus utilisées pour générer des films minces d’échantillons biologiques sur des grilles pour les études cryoEM 9,10. Ces méthodes consistent à appliquer quelques microlitres de solution d’échantillon sur une grille EM contenant un film fenêtré qui a été rendu hydrophile, puis à éponger la majorité de l’échantillon avec du papier filtre avant de plonger rapidement la grille dans un cryogène d’éthane liquide ou d’un mélange éthane-propane9.

Bien que cette méthode ait été utilisée avec succès pour déterminer les structures d’un large éventail d’échantillons biologiques, toutes les méthodes de préparation d’échantillons cryoEM couramment utilisées exposent les échantillons à l’interface air-eau (AWI) hydrophobe, ce qui introduit souvent des problèmes qui limitent la détermination de la structure à haute résolution. Il est établi que les spécimens biologiques ont une forte propension à se dénaturer lorsqu’ils sont exposés à l’AWI, ce qui peut conduire à une agrégation et à un désassemblage complexes11,12,13,14. De plus, les taches hydrophobes à la surface des échantillons biologiques font que les particules adoptent des orientations préférentielles dans la glace12. Dans de nombreux scénarios, une seule région hydrophobe de l’échantillon force toutes les particules à adopter une orientation singulière dans la glace, abolissant ainsi la capacité de générer une reconstruction fiable. En plus des problèmes liés à l’AWI, les échantillons peuvent démontrer une affinité pour la surface de la couche de film fenêtrée, ce qui limite le nombre de particules en suspension dans la glace à l’intérieur des trous15.

Plusieurs solutions méthodologiques et technologiques ont été développées pour diminuer ces problèmes découlant des interactions avec l’AWI ou les films16,17. Une approche populaire consiste à recouvrir le film fenêtré des grilles EM d’une fine couche (de dizaines de nanomètres) de carbone amorphe. Ce revêtement fournit une surface continue à travers les trous sur laquelle les particules peuvent s’adsorber, avec l’avantage de protéger partiellement l’échantillon des interactions avec l’AWI15,18,19,20. Cependant, la couche de carbone supplémentaire augmente la quantité de signal de fond dans les régions photographiées, introduisant un bruit qui peut compromettre la résolution atteignable, en particulier pour les petits spécimens (<150 kDa). Ces dernières années, l’utilisation de flocons d’oxyde de graphène (GO) pour produire des films de support sur des grilles cryoEM s’est avérée présenter des avantages par rapport au carbone amorphe traditionnel. Les flocons de GO sont produits par l’oxydation de couches de graphite, ce qui donne des feuilles pseudo-cristallines de graphite monocouche qui sont hydrophiles en raison de leur teneur substantielle en oxygène sous forme de groupes carboxyle, hydroxyle et époxy sur les surfaces et les bords. Les flocons de GO commerciaux en suspensions aqueuses sont peu coûteux, et il existe de nombreuses méthodes publiées pour appliquer les flocons de GO sur les grilles EM18,21. Cependant, ces méthodes aboutissent souvent à des grilles qui ne sont que partiellement recouvertes de flocons GO, ainsi qu’à des régions qui contiennent plusieurs couches de flocons GO. De plus, les flocons GO contribuent à un signal de fond notable aux images cryoEM qui est proche de celui observé avec le carbone amorphe mince22,23.

Le graphène monocouche vierge, qui se compose d’un seul réseau cristallin 2D d’atomes de carbone, se distingue du GO en ce qu’il ne produit pas de contraste de phase au microscope électronique. Le graphène monocouche peut ainsi être utilisé pour générer une couche de support invisible pour l’imagerie d’échantillons biologiques. Le graphène monocouche est également plus résistant que le GO et peut être appliqué en tant que monocouche unique sur une grille EM, et les progrès récents dans la fabrication de grilles EM recouvertes de graphène ont permis de préparer des grilles de graphène monocouche à haute couverture en interne 24,25,26,27,28,29,30 . Cependant, malgré les avantages de l’utilisation de grilles recouvertes de graphène pour la détermination de la structure cryoEM, elles ne sont pas largement utilisées en raison du coût prohibitif des options commerciales et de la complexité de la production interne. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour produire efficacement des grilles EM recouvertes d’une monocouche de graphène pour la détermination de la structure cryoEM d’échantillons biologiques (Figure 1). En suivant ce protocole détaillé, les chercheurs de cryoEM peuvent préparer de manière reproductible des dizaines de grilles de support en graphène de haute qualité en une seule journée. La qualité des grilles recouvertes de graphène peut être facilement examinée à l’aide d’un microscope électronique à transmission (MET) bas de gamme équipé d’un filament LaB6.

Protocol

1. Préparation des matériaux et accessoires nécessaires à la fabrication des grilles en graphène REMARQUE : Le graphène contamine facilement, ce qui réduit l’efficacité du revêtement en graphène et la qualité des grilles de graphène ; Par conséquent, il est important de nettoyer soigneusement tous les matériaux qui entrent en contact avec le graphène. La préparation des matériaux et toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte. Rassemblez les matériaux nécessaires qui seront utilisés pour recouvrir les grilles de graphène (figure 2A). Rincez la verrerie plusieurs fois avec de l’eau déminéralisée (DI) pour éliminer la poussière, les peluches et les résidus huileux. Utilisez des lingettes jetables pour nettoyer les lamelles de verre contenant de l’éthanol à 75 % et utilisez un dépoussiéreur à air pour éliminer tout contaminant.REMARQUE : Le bloc de support de grille TEM de serrage utilisé dans ce protocole peut contenir jusqu’à 45 grilles. Pour une production en grande série de grilles de graphène, 45 grilles ou moins peuvent être préparées à la fois. Cependant, il est recommandé de commencer par une production en petits lots (quatre à six grilles) jusqu’à ce que la méthode soit établie en laboratoire. 2. Préparation de 0,2 M de persulfate d’ammonium (APS) dans l’eau REMARQUE : Cette solution APS est utilisée comme agent de mordançage pour éliminer le support en cuivre (Cu) de la feuille de graphène/Cu dans une étape ultérieure. Préparez toujours une solution APS fraîche. Les solutions réutilisées ou anciennes ne graveront pas efficacement le cuivre et peuvent laisser des résidus de cuivre sur le graphène dans les étapes ultérieures. Rincez une fiole de 500 ml avec de l’eau déminéralisée (DI), puis ajoutez 200 mL d’eau déminéralisée et passez au micro-ondes en utilisant les réglages maximums pendant environ 1 minute pour dégazer l’eau. Ajouter 9 g de persulfate d’ammonium à 200 mL d’eau déminéralisée pour obtenir une solution de 0,2 M APS.ATTENTION : L’APS est toxique, il est conseillé de porter un équipement de protection individuelle (EPI) lors de la manipulation de l’APS. Éliminez les déchets APS dans une usine d’élimination des déchets agréée. Remuez la solution à l’aide d’une barre d’agitation sur un agitateur magnétique tout en connectant le ballon à une source de vide sous une hotte.REMARQUE : La solution APS de dégazage aidera à prévenir la formation de bulles, ce qui peut réduire l’efficacité de la gravure au cuivre à l’étape 6. 3. Transférez le graphène/cuivre sur une lamelle propre avec un morceau de papier buvard REMARQUE : Nous utilisons un film de graphène de dépôt chimique en phase vapeur (CVD) de 15 x 15 cm sur Cu provenant d’un fournisseur de graphène. Les feuilles monocouches de graphène/Cu achetées dans le commerce doivent être stockées sous vide. Comme le graphène est cultivé des deux côtés du Cu par la méthode CVD, les fournisseurs de graphène effectuent généralement des contrôles de qualité et recommandent le meilleur côté à utiliser. Nous nous référons à ce côté recommandé du graphène comme le côté « supérieur » tandis que l’autre côté est le côté « arrière » dans ce protocole. Découpez un morceau de papier buvard en forme rectangulaire d’environ 20 mm x 40 mm. Ce papier buvard est utilisé comme rembourrage pour la feuille de graphène/Cu et absorbera l’excès de méthacrylate de méthyle (MMA (8.5) MMA EL6) utilisé pour recouvrir la feuille de graphène/Cu ; par conséquent, assurez-vous de le couper dans une taille plus grande que la feuille de graphène/Cu à utiliser. Utilisez du ruban adhésif polyimide pour coller les quatre coins du papier buvard sur le dessus d’une lamelle propre qui s’insérera dans une vernisseuse maison.REMARQUE : Le ruban en polyimide est utilisé car il est mince et peut être retiré facilement, ce qui facilite la manipulation. Retirez un morceau de la feuille de graphène/Cu du stockage sous vide. Utilisez des ciseaux propres et sans poussière pour découper soigneusement un petit carré de la feuille de Cu-graphène qui sera suffisant pour couvrir complètement le nombre de grilles à préparer. Pour 25 grilles disposées en réseau 5 x 5, par exemple, découpez une pièce de 18 mm x 18 mm. Placez la feuille de graphène/Cu sur le papier buvard à l’aide d’une pince à épiler propre et sèche. Assurez-vous que la face arrière de la feuille de graphène/Cu est orientée vers le bas et veillez à ne pas retourner accidentellement la feuille de graphène/Cu car il est difficile de discerner la face supérieure de la face arrière. Collez les quatre coins de la feuille de graphène/Cu sur le papier buvard/lamelle, en minimisant la quantité de contact entre la bande et la feuille de graphène/Cu, car les régions recouvertes de ruban adhésif ne seront pas recouvertes de MMA à l’étape suivante.REMARQUE : Les décharges statiques peuvent endommager les films de graphène, et il est donc conseillé de rester mis à la terre électriquement et de minimiser l’accumulation de charge statique lors de la manipulation du graphène ou des grilles de graphène. Cela peut être accompli en portant une sangle de mise à la terre au poignet ou en touchant un objet métallique mis à la terre immédiatement avant de manipuler du graphène ou des grilles de graphène. 4. Enduisez la feuille de graphène/Cu monocouche d’une fine couche de MMA(8.5)MMA EL6 (MMA) REMARQUE : Une fois le Cu gravé, cette couche de MMA soutiendra la monocouche de graphène pour permettre la manipulation de la feuille de graphène dans les étapes futures. Le revêtement MMA permet également de visualiser le film de graphène puisqu’une monocouche de graphène seule serait transparente. Placez la lamelle avec la feuille de graphène/Cu collée sur une machine d’enrobage artisanale (qui peut être assemblée à l’aide d’un ventilateur d’ordinateur) à l’intérieur d’une hotte (figure 2B), comme décrit précédemment par Han et al.25. En portant des lunettes de sécurité, ajoutez deux gouttes de MMA à l’aide d’une pipette en verre sur la feuille de graphène et commencez immédiatement à tourner à la vitesse maximale. Pendant l’essorage, ajoutez deux autres gouttes au centre. Essorer pendant 1 min.REMARQUE : Assurez-vous qu’une quantité suffisante de MMA a été appliquée pour recouvrir complètement le graphène. En cas de doute, ajoutez quelques gouttes supplémentaires. Si le graphène n’est pas entièrement enrobé, des « trous » apparaissent dans le film après que le Cu ait été gravé. Laisser sécher à l’air libre pendant 10 min à l’intérieur d’une hotte. 5. Retirez le graphène à l’arrière de la feuille de graphène/Cu REMARQUE : Le graphène cultivé sur la face arrière du cuivre (la face non recouverte de MMA) doit être retiré avant de passer aux étapes suivantes, car cet excès de graphène réduira l’efficacité de la gravure au cuivre. Nous éliminons ce graphène en l’exposant au plasma, ce qui peut être accompli à l’aide de n’importe quel dispositif de décharge luminescente généralement utilisé pour préparer les grilles EM pour la préparation d’échantillons biologiques. Retirez délicatement le ruban adhésif et soulevez la feuille de graphène/Cu enduite de MMA de la lamelle avec une pince à épiler propre et sèche. Collez le morceau de la feuille MMA/graphène/Cu avec le côté MMA vers le bas sur une lamelle de verre propre et sans poussière. Placez la lamelle avec la feuille MMA/graphène/Cu dans le dispositif de décharge luminescente et appliquez les paramètres qui seraient généralement utilisés lors de la préparation des grilles pour la préparation d’échantillons de coloration négative ou de cryoEM.REMARQUE : Une décharge luminescente prolongée doit être évitée pour éviter l’oxydation du Cu sur la face arrière, ce qui peut entraîner une contamination des (nano)particules d’oxyde de cuivre (CuO) sur le film de graphène. 6. Graver le Cu de la feuille MMA/graphène/Cu dans une solution APS Dans une hotte, versez 200 mL de la solution APS fraîchement préparée dans une boîte de cristallisation propre et sans poussière (150 x 75 mm). Retirez la feuille de MMA/graphène/Cu de la lame de verre. Gardez une trace de quel côté contient le MMA. Pour commencer la gravure, placez la feuille de MMA/graphène/Cu avec le côté Cu traité au plasma vers le bas sur la surface de la solution APS. Couvrez le large bécher en verre avec un morceau de papier d’aluminium ou un couvercle pour empêcher la poussière d’entrer. Incuber pendant 3 h. Si la majeure partie du Cu n’est pas gravée après 1 h, répétez les étapes des sections 2 à 6, puis passez à l’étape suivante.REMARQUE : Si la majeure partie du Cu n’est pas gravée après 1 h, il est probable que le côté MMA/graphène du film ait été placé sur la surface de la solution APS au lieu du côté Cu. Le Cu doit être complètement gravé après 3 h, et le film MMA/graphène est incolore si le Cu est complètement gravé. Le graphène contamine facilement, alors assurez-vous de couvrir tous les récipients pour éviter l’accumulation de peluches ou de résidus graisseux sur les surfaces, car cela aura un impact négatif sur la qualité du graphène. 7. Rincez le film MMA/graphène dans de l’eau DI Dans une hotte, remplissez un récipient de cristallisation propre et sans poussière avec de l’eau déminéralisée. Ramassez délicatement le film graphène-MMA à l’aide d’une lamelle en verre propre et sans poussière positionnée à un angle de ~45° par rapport à la surface de la solution APS. Positionnez la lame de verre à un angle de près de 90° par rapport à l’eau et abaissez doucement la lamelle de verre dans l’eau de sorte que le MMA/graphène glisse lentement hors de la lame et flotte à la surface de l’eau. Laissez le film MMA/graphène à la surface de l’eau pendant 1 h pour éliminer tout APS. 8. Nettoyez les grilles à recouvrir d’une monocouche de graphène REMARQUE : Les grilles sur lesquelles le graphène sera transféré doivent être aussi propres que possible pour maximiser la fixation du graphène à la surface de la feuille de grille. Les grilles achetées dans le commerce contiennent souvent des contaminants résiduels qui doivent être éliminés avant le transfert du graphène. Nettoyez et séchez trois boîtes de cristallisation afin qu’elles soient exemptes de poussière. Dans une hotte, versez 200 ml de chloroforme, d’acétone et d’alcool isopropylique (IPA) dans chacun des trois plats de cristallisation. Couvrir les plats de cristallisation avec du papier d’aluminium pour minimiser l’évaporation des solvants organiques.ATTENTION : Le chloroforme et l’acétone provoquent une irritation de la peau et peuvent être toxiques s’ils sont inhalés. Limitez l’exposition à ces solvants organiques et portez des EPI. Placez la base du bloc de support de grille TEM de serrage au fond de la première boîte de cristallisation contenant 200 mL de chloroforme. Transférez chaque grille individuellement de la boîte de grille vers un puits dans le bloc de support de grille, en veillant à ce que le côté du film fenêtré soit orienté vers le haut. Couvrez le plat de cristallisation avec du papier d’aluminium, placez-le sur un shaker orbital et secouez doucement pendant 30 min. Placez le couvercle métallique sur le bloc porte-grille, ce qui fixera les grilles lors du transfert vers le prochain plat de cristallisation. Soulevez délicatement le bloc de support de grille hors de la boîte de cristallisation à l’aide d’une fourchette pliée et d’une longue pince à épiler et placez-le au fond de la deuxième boîte de cristallisation contenant 200 ml d’acétone. Retirez le couvercle du bloc de support de grille et secouez doucement sur un agitateur orbital pendant 30 min. Placez le couvercle sur le bloc porte-grille et transférez-le dans un récipient de cristallisation contenant 200 mL de solution d’alcool isopropylique pour éliminer les résidus d’acétone. Retirez le couvercle du bloc de support de grille et secouez doucement pendant 20 min. Transférez individuellement les grilles avec le côté du film fenêtré vers le haut du bloc porte-grille dans une boîte de Pétri en verre recouverte de papier buvard. Séchez les grilles pendant au moins 30 min sous la hotte, en veillant à ce que les grilles soient recouvertes pour éviter que la poussière n’y atterrisse. 9. Transférez les grilles propres sur du papier buvard placé sur un treillis métallique en acier inoxydable ou un plateau perforé sous de l’eau DI REMARQUE : Les grilles doivent être immergées sous l’eau DI sur une surface plane afin que le graphène puisse flotter sur l’eau et être abaissé sur les grilles. Cela peut être effectué à l’aide d’une auge de revêtement de grille commerciale ou d’une boîte de Pétri et d’une pompe péristaltique, comme utilisé pour générer des grilles d’oxyde de graphène, comme décrit par Palovcak et al.18. Placez le treillis ou le plateau en acier inoxydable dans une auge de revêtement en grille et rincez à l’eau détritus. Coupez le papier buvard légèrement plus petit que la maille/plateau en acier inoxydable et placez-le sur le dessus de la plate-forme, immergé dans l’eau DI.REMARQUE : Le papier buvard est légèrement plus petit que la plate-forme pour permettre le mouvement et la manipulation. Transférez délicatement les grilles nettoyées avec le côté fenêtré du film vers le haut sur le papier buvard. Les grilles seront probablement hydrophobes, alors immergez-les verticalement dans l’eau ou elles peuvent se plier en raison de la tension de l’eau. Positionnez les grilles dans un réseau carré de manière à ce qu’elles soient aussi proches que possible les unes des autres, mais sans se chevaucher (Figure 2C). Les grilles sont maintenant prêtes à être recouvertes d’une monocouche de graphène. Remplissez la cuvette de revêtement de la grille avec plus d’eau DI afin que la surface de l’eau soit d’au moins 5 mm au-dessus des grilles. 10. Transférer le graphène sur les grilles Retirez soigneusement le film MMA/graphène du plat de cristallisation avec une lamelle propre en abaissant lentement la lamelle dans l’auge à un angle, à une certaine distance du film de graphène. Placez la lamelle sous la feuille de graphène-MMA de manière à ce que les bords de la feuille et de la lamelle soient parallèles, puis soulevez la lamelle verticalement hors de l’eau, en emportant le film MMA/graphène avec elle. Transférez le film MMA/graphène dans l’auge en abaissant la lamelle dans l’eau à un angle de ~45°, de sorte que le film MMA/graphène se détache de la lamelle et flotte à la surface de l’eau. Positionnez le film MMA/graphène directement au-dessus des grilles avant que le niveau d’eau ne soit abaissé. Utilisez une pipette Pasteur en verre dont la pointe a été fondue pour sceller l’ouverture afin de manipuler soigneusement la position du film MMA/graphène. Abaissez lentement le niveau d’eau à l’aide de la seringue, à environ 1,25 mL/min de manière à ce que le film MMA/graphène recouvre entièrement les surfaces de la grille lorsqu’il atterrit sur le papier filtreREMARQUE : Une manipulation supplémentaire de la feuille de graphène-MMA peut être nécessaire pour maintenir sa position au-dessus des grilles lorsque le niveau d’eau baisse. Utilisez une pince à épiler propre et sèche pour soulever le papier buvard qui maintient les grilles dans une boîte de Pétri propre, sèche et sans poussière, ou transférez l’ensemble de la plate-forme en acier inoxydable. Faites sécher les grilles MMA/graphène à l’air libre pendant au moins 30 minutes sous la hotte. Gardez les grilles recouvertes de papier d’aluminium ou d’un couvercle pour éviter toute contamination par des particules de poussière. Transférez les grilles dans un incubateur et faites-les cuire dans un incubateur à 65 °C pendant 30 min. Retirez les grilles de l’incubateur et laissez-les couvertes pendant 5 minutes à température ambiante pour refroidir les grilles à température ambiante. 11. Retrait du MMA et nettoyage des grilles REMARQUE : Le MMA doit être soigneusement lavé à l’acétone pour éviter tout résidu de MMA sur les grilles recouvertes de graphène. Dans une hotte, préparer deux plats de cristallisation contenant 200 mL d’acétone et un plat de cristallisation contenant 200 mL d’isopropanol (IPA) à température ambiante. Couvrir les plats de cristallisation avec du papier d’aluminium pour minimiser l’évaporation des solvants organiques.ATTENTION : Portez un EPI lorsque vous manipulez de l’acétone, car elle peut provoquer une irritation de la peau et peut être nocive en cas d’inhalation. Placez la base du bloc de support de grille TEM de serrage au fond de la première boîte de cristallisation contenant 200 mL d’acétone fraîche. Transférez chaque grille individuellement du papier buvard vers un puits dans le bloc de support de grille, en veillant à ce que le côté MMA soit orienté vers le haut. Couvrez le plat de cristallisation avec du papier d’aluminium, placez-le sur un shaker orbital et secouez doucement pendant 30 min. Placez le couvercle métallique sur le bloc porte-grille, ce qui fixera les grilles lors du transfert vers le prochain plat de cristallisation. Soulevez délicatement le bloc de support de grille hors de la boîte de cristallisation à l’aide d’une fourchette pliée et d’une longue pince à épiler et placez-le au fond de la deuxième boîte de cristallisation contenant 200 ml d’acétone fraîche. Retirez le couvercle du bloc de support de grille et secouez doucement sur un agitateur orbital pendant 30 min. Placez le couvercle sur le bloc porte-grille et transférez-le dans le récipient de cristallisation contenant 200 mL de solution IPA pour nettoyer les résidus d’acétone. Retirez le couvercle du bloc de support de grille et secouez doucement pendant 20 min. Transférez les grilles dans une petite boîte de Pétri en verre recouverte de papier buvard et séchez les grilles à l’air libre pendant au moins 10 min. Gardez les grilles recouvertes d’un couvercle pour éviter toute contamination par des particules de poussière. Les grilles sont prêtes à être utilisées ou transférées dans une boîte de grille enveloppée de papier d’aluminium à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide.REMARQUE : Le stockage de grilles de graphène à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide peut empêcher la contamination des particules hydrophobes des conditions ambiantes. Ces grilles peuvent être stockées jusqu’à plusieurs mois avant d’être utilisées27. 12. Rendre les grilles de graphène hydrophiles avec un traitement UV/Ozone REMARQUE : Le graphène est extrêmement hydrophobe, ce qui n’est pas compatible avec la préparation d’échantillons cryoEM, car les approches par transfert nécessitent une surface hydrophile sur laquelle une goutte d’échantillon peut se répandre uniformément. Alors que les dispositifs traditionnels à décharge luminescente peuvent être configurés pour pulser doucement le plasma afin de rendre la surface du graphène hydrophile, ces dispositifs ont tendance à détruire la fine monocouche de graphène. Il a déjà été démontré qu’un nettoyant UV/ozone peut être utilisé pour oxygéner partiellement la surface du graphène25, le rendant hydrophile pour la préparation d’échantillons cryoEM sans endommager la monocouche. Si vous utilisez un système UV/Ozone qui nécessite un amorçage, allumez le système et amorcez la lampe pendant 10 minutes (à cette étape, assurez-vous qu’aucune grille n’est exposée). Pendant que le nettoyeur UV/ozone s’apprête, retirez les grilles du dessiccateur sous vide et transférez-les sur une lamelle propre. Lorsque le système UV/Ozone est prêt, placez la lamelle contenant les grilles avec le côté graphène vers le haut dans le nettoyant UV/ozone, et exposez les grilles à l’ozone gazeux pendant 4 min. Après l’exposition à l’ozone, utilisez immédiatement les grilles pour la préparation des échantillons cryoEM.REMARQUE : Si vous utilisez un système UV/Ozone qui nécessite un amorçage, les grilles doivent être placées dans le nettoyeur immédiatement après que la lampe a été amorcée pendant 10 minutes, sinon il fera trop froid pour produire suffisamment d’ozone gazeux pour oxygéner le graphène pour la préparation de l’échantillon. N’exposez pas les grilles à l’ozone gazeux pendant plus de 6 minutes, car cela détruirait la couche de graphène.

Representative Results

L’exécution réussie du protocole de fabrication de grilles de graphène décrit ici se traduira par des grilles EM entièrement recouvertes d’une seule monocouche de graphène. La couverture en graphène des grilles peut être vérifiée à l’aide de n’importe quel MET. Étant donné qu’une monocouche de graphène propre est presque invisible dans le MET, il faut l’examiner en utilisant le mode de diffraction du microscope et observer les taches de Bragg correspondant à l’organisation hexagonale des atomes de carbone qui composent le graphène (Figure 3A). Il est normal d’observer occasionnellement des plis de graphène monocouche, qui sont introduits lors du revêtement MMA (Figure 3B). On peut également vérifier le niveau de contamination présent sur le graphène en acquérant une image à fort grossissement au centre de l’un des trous recouverts de graphène (Figure 3C). Si elle est acquise avec un détecteur à haute résolution, une transformée de Fourier de cette image devrait contenir des taches de Bragg correspondant à un espacement carbone-carbone à 2,14 Å (Figure 4C). Une monocouche d’atomes de carbone ne produit pas une diffusion d’électrons suffisante pour générer un contraste de phase, et donc une image de graphène propre ne présentera pas d’anneaux de Thon associés à la fonction de transfert de contraste dans une transformée de Fourier de l’image. Cependant, il est très difficile d’empêcher la contamination des grilles de graphène après leur production, et un lavage insuffisant des grilles EM ou l’élimination du MMA après le revêtement de graphène entraînera des contaminants notables sur les grilles qui sont visibles dans les images de l’espace réel (Figure 3C). Comme le montre la figure 4, les grilles de graphène ont un effet de concentration sur un échantillon, comme on l’observe lorsque l’on compare 0,5 mg/mL d’apoferritine appliqué à des grilles d’or trouées avec (figure 4A) et sans le support de graphène (figure 4B). Des protocoles similaires de fabrication de graphène ont déjà été décrits pour résoudre les structures cryoEM de protéines telles que l’apoferritine à haute résolution25,27. Figure 1 : Schéma de préparation des grilles cryoEM recouvertes de graphène. Les étapes clés du processus de fabrication d’une grille de graphène sont illustrées. Abréviations : cryoEM = microscopie électronique cryogénique ; MMA = méthacrylate de méthyle ; APS = persulfate d’ammonium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Matériaux requis pour la fabrication de grilles en graphène. (A) Les matériaux nécessaires au revêtement des grilles cryo-EM sont étiquetés en conséquence. (B) Vue rapprochée de l’enduiseur avec une feuille de graphène/Cu collée sur un papier buvard sur une lame de verre. L’enrobeuse par centrifugation peut être assemblée en achetant des pièces dans un magasin d’informatique ou de quincaillerie local. (C) Vue rapprochée de l’auge de revêtement de la grille fixée à une seringue qui peut être utilisée pour contrôler le niveau d’eau. Les grilles sont placées au-dessus d’un papier buvard sur un treillis en acier inoxydable. Le papier buvard aide à manœuvrer l’emplacement des grilles afin que la feuille de graphène puisse y être adaptée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Image représentative d’un motif de diffraction et images en fond clair d’une grille de graphène montrant des rides ou une contamination par le MMA. (A) Les grilles EM recouvertes d’une monocouche de graphène montreront des pics de Bragg correspondant au réseau hexagonal du graphène lorsqu’elles sont imagées dans un MET en mode diffraction. Le pic de Bragg correspondant à l’espacement carbone-carbone de 2,14 Å est encerclé et indiqué par une flèche. (B) Une image en fond clair d’une grille de graphène monocouche avec quelques rides (indiquées par une flèche) dans la monocouche de graphène. (C) Une image en fond clair de graphène monocouche contaminé par le MMA (indiqué par une flèche). Barres d’échelle = 100 nm (B,C). Abréviations : EM = microscopie électronique ; MMA = méthacrylate de méthyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène : (A) Micrographie CryoEM de 0,5 mg/mL d’apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène. (B) L’apoferritine imagée à la même concentration est visible à une concentration nettement plus faible lorsqu’elle est préparée à l’aide de grilles d’or trouées sans graphène. (C) FFT de la micrographie cryoEM de 0,5 mg/mL d’apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène, les pics de Bragg correspondant au réseau hexagonal de graphène indiqué. Barres d’échelle = 100 nm (A,B). Abréviations : cryoEM = microscopie électronique cryogénique ; FFT = transformée de Fourier rapide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La conservation d’échantillons biologiques dans une fine couche de glace vitreuse est une étape cruciale pour la détermination de la structure cryoEM à haute résolution. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des problèmes découlant des interactions avec l’AWI, qui introduit l’orientation préférée, le désassemblage complexe, la dénaturation et l’agrégation. De plus, les échantillons ne peuvent pas toujours être suffisamment concentrés pour peupler la mince glace en suspension dans les trous d’une pellicule fenêtrée. Plusieurs groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour recouvrir les grilles EM d’une monocouche de graphène afin d’aider à surmonter certaines de ces limitations 24,25,26,27,28,29,30, et les grilles de graphène ont été utilisées avec beaucoup de succès. Ici, nous fournissons des instructions étape par étape pour préparer efficacement des lots de grilles de graphène en interne et examiner la qualité des grilles de graphène par MET. Nous insistons sur le fait qu’une attention particulière doit être exercée lors de certaines des étapes critiques, que nous décrivons ci-dessous.

Le graphène a une forte tendance à attirer les contaminants en suspension dans l’air. Par conséquent, pendant le processus de fabrication de la grille de graphène, il est important de s’assurer que tous les outils qui entrent en contact avec la feuille de graphène/Cu ou les grilles sont propres et exempts de poussière. Les lamelles en verre utilisées pour transférer le graphène peuvent être nettoyées en les rinçant à l’éthanol et à l’eau déminéralisée ou en utilisant un dépoussiéreur à air. Il est également conseillé de travailler sous une hotte et de garder les feuilles et les grilles de graphène recouvertes de papier d’aluminium ou d’une plaque de verre propre à tout moment. La poussière ou les contaminants sur les grilles peuvent empêcher le graphène d’adhérer complètement aux grilles EM. Lors de la manipulation de graphène ou de grilles recouvertes de graphène, il est important d’être mis à la terre électriquement pour éviter d’endommager le film de graphène en raison d’une décharge statique. Les décharges électrostatiques peuvent être évitées en utilisant une sangle de mise à la terre au poignet, en touchant un objet métallique mis à la terre chaque fois que des grilles en graphène ou en graphène sont manipulées, et/ou en ne portant pas de gant sur la main tenant la pince à épiler24.

Étant donné qu’une monocouche de graphène est très mince (la largeur d’un atome de carbone), il est important de soutenir le graphène avec une couche organique telle que le MMA ou le poly-MMA (PMMA) lors du transfert du graphène sur les grilles. Le PMMA est le matériau le plus utilisé pour le transfert de graphène. Cependant, le PMMA a une forte affinité avec le graphène et peut souvent entraîner une contamination du polymère sur le film de graphène. Le MMA est utilisé dans ce protocole, car il laisse moins de contamination résiduelle25. Cependant, le PMMA et le MMA ont tous deux l’inconvénient de former des rides et des fissures qui peuvent être observées dans certaines zones du film de graphène (Figure 3B). Il peut être difficile d’éviter ces rides car elles se produisent généralement lors de la croissance du graphène par la méthode CVD31. Une méthode a été récemment mise au point pour faire pousser du graphène ultra-plat sans plis, dans laquelle la feuille de cuivre est remplacée par une plaquette de Cu(111)/saphir comme substrat de croissance32.

Sur la base de notre expérience, il est préférable d’acheter des feuilles de graphène/Cu et de soutenir le graphène avec du MMA en interne plutôt que d’acheter des feuilles de Cu-graphène recouvertes de polymère auprès de fabricants, qui deviennent cassantes après la gravure sur cuivre et sont difficiles à manipuler dans les étapes ultérieures. La machine de revêtement par centrifugation que nous avons utilisée pour le revêtement MMA peut être construite à moindre coût à l’aide de pièces provenant d’un magasin d’informatique ou de quincaillerie local, comme décrit précédemment25.

Lors de l’étape du revêtement MMA, il est important de recouvrir l’intégralité de la surface du graphène sur la feuille de Cu-graphène avec du MMA. Une fois que le Cu a été gravé, le MMA-graphène deviendra semi-transparent et les zones dépourvues de couverture MMA ressembleront à des trous vides. Pour éviter le revêtement MMA du côté du cuivre, il est important de placer un petit morceau de papier buvard en dessous pendant le revêtement afin qu’il absorbe tout excès de MMA qui s’échappe du film CVD.

Après la gravure et le rinçage, la feuille de MMA/graphène est prête à être transférée sur les grilles EM en utilisant un système d’auge commercial ou fait maison avec une seringue ou une pompe péristaltique pour contrôler le niveau d’eau. Avant l’étape de transfert, il est important de bien prérincer les grilles dans des bains successifs de chloroforme, d’acétone et d’IPA. La cuisson des grilles recouvertes de graphène à 65 °C permet de préserver l’intégrité du graphène et favorise l’adsorption du graphène sur les grilles. Enfin, pour éviter la contamination par le MMA sur les grilles, il est important de bien retirer le MMA dans un bain d’acétone et de nettoyer les grilles dans de l’IPA. Tout résidu de MMA non lavé sera observé sur les grilles EM et diminuera le rapport signal/bruit des images (Figure 3C). Le processus de lavage à l’acétone-IPA peut être répété pour nettoyer davantage les surfaces en graphène.

Pour rendre les grilles de graphène hydrophiles, nous les avons exposées aux UV/Ozone. Différents modèles de nettoyants UV/ozone peuvent nécessiter une optimisation pour oxygéner suffisamment la couche de graphène pour la préparation d’échantillons cryoEM sans endommager le graphène. Quel que soit le système, il est essentiel d’utiliser ces grilles pour l’application d’échantillons cryoEM immédiatement après le traitement UV/Ozone. Des méthodes alternatives pour rendre les grilles de graphène hydrophiles sont décrites dans d’autres études33,34.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Xiao Fan pour les discussions utiles lors de la mise en place de ces méthodes chez Scripps Research. B.B. a bénéficié d’une bourse de recherche postdoctorale de la Fondation Hewitt pour la recherche médicale. W.C. est soutenu par une bourse prédoctorale de la National Science Foundation. D.E.P est soutenu par les NS095892 de subvention des National Institutes of Health (NIH) à G.C.L. Ce projet a également été soutenu par des subventions du NIH GM142196, GM143805 et S10OD032467 à G.C.L.

Materials

70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES
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Riferimenti

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -. G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -. S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

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Cryoelectron MicroscopyGrapheneMonolayerSample PreparationAir-water InterfaceHydrophobic EffectDenaturationAggregationComplex DissociationPreferred OrientationBackground NoiseProtein Concentration

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Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).
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