희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

신진대사는 모든 살아있는 세포에서 발생하는 필수적인 생물학적 과정입니다. 대사 과정에는 밀접하게 조절되고 상호 연결된 방대한 생화학 반응 네트워크가 포함되며, 이를 통해 세포는 에너지를 생산하고 필수 생체 분자를 합성할 수 있습니다¹. 대사 네트워크의 기능을 이해하기 위해 연구자들은 세포 내 저분자 중간체의 수준을 측정합니다. 이러한 중간체는 대사 활동의 중요한 지표 역할을 하며 세포 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

질량분석법(MS)은 복잡한 시료 ^1,2에서 대사 산물의 특이적 검출을 위해 가장 널리 사용되는 선택입니다. 핵 자기 공명(NMR)은 화합물의 절대 정량화 및 구조 규명에 장점이 있지만, MS는 종종 생체 유체 또는 세포 추출물과 같은 복잡한 혼합물에서 더 많은 성분을 분해할 수 있습니다. MS는 모세관 전기영동(CE), 가스 크로마토그래피(GC) 또는 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 화합물의 사전 분리와 결합되는 경우가 많습니다³. 분리 플랫폼의 선택은 대부분 표적 대사 산물의 범위와 시료 유형에 따라 결정되며, 실제 환경에서는 기계 및 전문 지식의 가용성에 따라 결정됩니다. 세 가지 분리 플랫폼 모두 광범위하고 겹치는 범위의 적합한 대사 산물을 가지고 있지만 한계는 다릅니다. 간단히 말해서, CE는 하전 분자만 분리할 수 있으며 많은 수의 샘플에 대한 강력한 분석을 구현하려면 많은 전문 지식이 필요합니다⁴. GC는 분해되기 전에 증발할 수 있을 만큼 작고 무극성인 분자로 제한됩니다³. 상업적으로 이용 가능한 모든 LC 컬럼을 고려할 때, 임의의 두 대사 산물은 이 기술로 분리될 수 있다⁵. 그러나 많은 LC 분석법은 길이가 비슷한 CE 또는 GC 분석법보다 분해능이 떨어집니다.

대사체학 측정을 위한 출발 물질의 일반적인 양은 일반적으로 샘플당 5 x 10⁵ 내지 5 x 10⁷ 세포, 5-50 mg의 습윤 조직 또는 5-50 μL의 체액⁶ 범위이다. 그러나 조혈모세포(HSC) 또는 순환 종양 세포와 같은 희귀 세포 유형의 일차 세포를 다룰 때 이러한 양의 시작 물질을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 세포는 종종 매우 적은 수로 존재하며 중요한 세포 기능을 손상시키지 않고는 배양할 수 없습니다.

HSC와 다분화능 전구세포(MPP)는 조혈계에서 가장 분화가 적은 세포이며 유기체의 일생 동안 지속적으로 새로운 혈액 세포를 생성합니다. 조혈의 조절은 백혈병 및 빈혈과 같은 상태에서 임상적으로 관련이 있습니다. 그 중요성에도 불구하고 HSC와 MPP는 조혈계 내에서 가장 희귀한 세포 중 하나입니다. 단일 마우스에서 일반적으로 약 5000개의 HSC를 분리할 수 있습니다 ^7,8,9. 전통적인 대사체학 방법은 더 많은 투입 물질을 필요로 하기 때문에 희귀 세포 유형을 분석하기 위해 여러 마우스의 세포를 풀링하는 것이 종종 필요했습니다^10,11.

여기에서, 우리는 단일 마우스(¹²)의 HSC로부터 대사체학 데이터를 생성할 수 있도록 샘플당 5000개 세포만큼 작은 세포에서 대사체의 측정을 가능하게 하는 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 동시에 이 방법을 사용하면 림프구와 같은 더 풍부한 세포 유형에 대해 단일 마우스에서 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이 접근 방식은 주어진 프로젝트에 필요한 동물의 수를 줄여 동물 실험의 “3R”(축소, 대체, 개선)에 기여합니다.

세포의 대사 산물은 종종 초¹³ 정도로 매우 높은 회전율을 가질 수 있습니다. 그러나 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 시료 준비는 몇 시간이 걸릴 수 있으며, FACS 분류 자체는 몇 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 비생리학적 조건으로 인해 대사체에 잠재적인 변화가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 일부 시약(예: 암모늄-클로라이드-칼륨[ACK] 용해 완충액)은 유사한 효과를 가질 수 있습니다. 이러한 조건은 세포 스트레스를 유발하고 세포 내 대사 산물의 수준과 비율에 영향을 미쳐 세포 대사의 부정확하거나 편향된 측정으로 이어질 수 있습니다 14,15,16. 시료 전처리로 인한 대사 변화는 때때로 분류 아티팩트(sorting artifact)라고 합니다. 단단하거나 질긴 조직에서 단세포 현탁액을 생성하는 데 필요할 수 있는 긴 분해 프로토콜과 가혹한 시약은 이 문제를 악화시킬 수 있습니다. 발생할 수 있는 변화는 셀 유형 및 처리 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 변화의 정확한 성질은 살아있는 조직에서 방해받지 않은 세포의 대사 상태를 측정할 수 없기 때문에 알려지지 않았습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 기존 방법과 비교하여 몇 가지 주요 차이점, 즉 5g/L NaCl을 피복 유체로 사용, 추출 완충액으로 직접 분류, 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피-질량분석법(HILIC-MS)에 대량의 시료 주입, 표적 정량 활용, 내부 표준물질 및 백그라운드 제어의 엄격한 사용(그림 1)). 이 프로토콜은 세포 유형 간, 그리고 약물 처리와 차량 제어 사이의 차이를 상당 부분 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있다¹². 배양된 세포의 경우에도 보다 확립된 원심분리 및 상층액의 수동 제거와 같은 대체 접근 방식과 유리하게 비교됩니다. 그러나 정렬 아티팩트가 계속 발생할 수 있으므로 데이터를 주의해서 해석해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 대사 프로파일링 분야에서 상당한 개선을 나타내며, 희귀 일차 세포에서 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있게 한다¹².

희귀 일차 세포에서 광범위한 대사 프로파일을 강력하게 측정할 수 있는 능력은 이러한 세포와 관련된 생물 의학 연구의 새로운 실험의 문을 열어줍니다. 예를 들어, HSC의 대사 매개 조절은 빈혈 및 백혈병에 대한 영향과 함께 휴면 자가 재생 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다^11,17. 환자 유래 순환 종양 세포에서 종양과 인접 세포 간의 대사 유전자 발현의 차이가^18,19로 나타났습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 일반적으로 유전자 발현보다 세포 표현형에 더 가까운 것으로 간주되는 대사 수준에서 이러한 차이를 체계적으로 연구할 수 있습니다.