הכנת זרעי דקל קשים לניתוח ספקטרומטריית מסה בסיוע מטריקס בלייזר/יינון-הדמיה
Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר הנחיות מפורטות להכנת קטעי דגימת זרעים קשים עם תכולת מים נמוכה לניתוח MALDI-IMS, שמירה על הפיזור והשפע המקוריים של האנליסטים ומתן אות ורזולוציה מרחבית באיכות גבוהה.
Abstract
ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) מיושמת לזיהוי תרכובות בסביבות הטבעיות שלהן. נכון לעכשיו, MALDI-IMS משמש לעתים קרובות בניתוח קליני. ובכל זאת, קיימת פרספקטיבה מצוינת ליישום טוב יותר של טכניקה זו להבנת המידע הפיזיולוגי של תרכובות כימיות ברקמות צמחים. עם זאת, ההכנה עשויה להיות מאתגרת עבור דגימות ספציפיות מחומרים בוטניים, מכיוון ש- MALDI-IMS דורש פרוסות דקות (12-20 מיקרומטר) לרכישת נתונים מתאימה וניתוח מוצלח. במובן זה, בעבר, פיתחנו פרוטוקול הכנת דגימות כדי להשיג מקטעים דקים של זרעים קשים של Euterpe oleracea (דקל açaí), המאפשר את המיפוי המולקולרי שלהם על ידי MALDI-IMS.
כאן, אנו מראים כי הפרוטוקול שפותח מתאים להכנת זרעים אחרים מאותו סוג. בקצרה, הפרוטוקול התבסס על טבילת הזרעים במים נטולי יונים, הטבעה של דגימות עם ג’לטין, וחתך אותם בהקפאה מאוקלמת. לאחר מכן, עבור שקיעת מטריצה, פלטפורמת תנועה xy הוצמדה לתרסיס מחט יינון אלקטרוספריי (ESI) באמצעות 1:1 (v/v) 2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) ותמיסת מתנול עם 0.1% חומצה trifluoroacetic ב 30 מ”ג / מ”ל. נתוני זרעי E. precatoria ו- E. edulis עובדו באמצעות תוכנה כדי למפות את דפוסי המטבוליטים שלהם.
אוליגומרים הקסוזים מופו בתוך פרוסות דגימה כדי להוכיח את נאותות הפרוטוקול עבור דגימות אלה, שכן ידוע כי זרעים אלה מכילים כמויות גדולות של מנאן, פולימר של מנוז הקסוס. כתוצאה מכך, זוהו פסגות של אוליגומרים הקסוזיים, המיוצגים על ידי [M + K]+ adducts of (Δ = 162 Da). לפיכך, פרוטוקול הכנת הדגימה, שפותח בעבר בהתאמה אישית עבור זרעי E. oleracea , איפשר גם ניתוח MALDI-IMS של שני זרעי דקל קשים אחרים. בקיצור, השיטה יכולה להוות כלי רב ערך למחקר במורפו-אנטומיה ובפיזיולוגיה של חומרים בוטניים, במיוחד מדגימות עמידות לחיתוך.
Introduction
ספקטרומטריית מסה של ספיחת לייזר/יינון-הדמיה בסיוע מטריצה (MALDI-IMS) היא שיטה רבת עוצמה המאפשרת הקצאה דו-ממדית של ביומולקולות, מספקת חקירה לא ממוקדת של תרכובות מייננות וקובעת את התפלגותן המרחבית, במיוחד בדגימות ביולוגיות 1,2. במשך שני עשורים, טכניקה זו אפשרה זיהוי בו זמנית של שומנים, פפטידים, פחמימות, חלבונים, מטבוליטים אחרים, ומולקולות סינתטיות כגון תרופות טיפוליות 3,4. MALDI-IMS מאפשר ניתוח כימי במשטח דגימת רקמה ללא מיצוי, טיהור, הפרדה, תיוג או צביעה של דגימות ביולוגיות. עם זאת, לניתוח מוצלח, שלב מרכזי בטכניקה זו הוא הכנת הדגימה, במיוחד ברקמות צמחים, אשר מתמחים ומותאמים לאיברים מורכבים נרחבים עקב התאקלמות סביבתית5.
בגלל התכונות הפיזיקוכימיות הטבועות ברקמת הצמח, יש צורך בפרוטוקול מותאם שיתאים לדרישות ניתוח MALDI-IMS וישמור על צורתה המקורית של הרקמה במהלך הכנת חתך 6,7. במקרה של דגימות לא קונבנציונליות, כגון זרעים, פרוטוקולים שנקבעו8 אינם ישימים מכיוון שלרקמות אלה יש קירות תאים קשיחים ותכולת מים נמוכה, מה שיכול בקלות לגרום לפיצול חתכים ולהוביל לדלוקליזציה מורכבת9.
קבוצת המחקר שלנו פרסמה נתונים ניסיוניים על מיפוי מולקולרי ופרוטוקול מותאם לניתוח MALDI-IMS של זרעי açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, שהוא תוצר לוואי שנוצר בכמויות גבוהות במהלך הייצור של עיסת אסאי להשכרה 13. הרעיון היה לפתח פרוטוקול למיפוי באתרו של מטבוליטים שונים בזרעי אסאי, ובכך להציע שימושים אפשריים לפסולת חקלאית זו, שכיום אינם נחקרים באופן מסחרי. עם זאת, בשל ההתנגדות של זרע açaí, היה צורך להתאים פרוטוקול כדי לקבל חתך דגימה כראוי מניתוח MALDI-IMS.
בהקשר זה, עיסת האסאי החשובה מבחינה כלכלית הניעה את המסחור הגובר של פירות אחרים מעצי דקל מסוג Euterpe בעלי מאפיינים חושיים דומים. שני הפירות המתעוררים של עצי דקל שהופקו בקנה מידה תעשייתי כחלופה לאסאי14,15 הם E. precatoria (המכונה açaí-do-amazonas), הגדל באזור היבש של האמזונס, ו– E. edulis (המכונה juçara), האופייני ליער האטלנטי. עם זאת, צריכת açaí-do-amazonas ו juçara מוביל לאותה הצטברות של זרעים עמידים ובלתי אכילים שאינם ניצלו ולא נחקרו עד כה לגבי הרכבם הכימי המפורט.
לפיכך, אנו מראים כאן כי ניתן להשתמש בפרוטוקול שתוכנן בעבר, עם מעט התאמות, כדי לנתח זרעי E. precatoria ו- E. edulis למיפוי מולקולרי על ידי MALDI-IMS, מה שמוכיח שהוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו לניתוח הרכב המשאבים הללו ויכול לסייע בקביעת השימושים הביוטכנולוגיים הפוטנציאליים שלהם. יתר על כן, התיאור המפורט המובא כאן יכול לסייע לאחרים עם קשיים דומים בהכנת חומרים עמידים לניתוח MALDI-IMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
צמחים מורכבים מרקמות מיוחדות עבור פונקציות ביוכימיות ספציפיות. לכן, פרוטוקול הכנת הדגימות עבור MALDI-IMS חייב להיות מתוכנן על פי רקמות צמחים שונות בעלות תכונות פיסיקוכימיות ספציפיות, שכן הדגימות חייבות לשמור על פיזור האנליזה והשפע המקוריים שלהן לקבלת אות באיכות גבוהה ורזולוציה מרחבית<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מכון סראפילהיירה (Serra-1708-15009), וקרן קרלוס צ’אגס פיליו לתמיכה במחקר במדינת ריו דה ז’ניירו (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). מכון סראפילהיירה והמועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) העניקו מלגות לד”ר פליפה לופס ברום וד”ר גבריאל ר. מרטינס (Institutional Capacity Building Program/INT/MCTI). התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES) מוכר על הענקת מלגת מאסטר למר דייווי מ. מ. כ. דה סילבה. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) מוכר בזכות השירותים הניתנים עם ניתוחי MALDI-IMS, ומר אלן מנזס דו נסימנטו והמרכז לננוטכנולוגיה וקטליס (CENANO-INT), הממומנים על ידי MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ grant Nº 442604/2019, מודים על ניתוח ההרכב היסודי.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
Riferimenti
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
