Отслеживание липидов de novo с помощью мечения стабильными изотопами LC-TIMS-TOF MS/MS

При анализе липидных данных мечение стабильными изотопами (SIL) является эффективным методом оценки метаболических путей в живых организмах. В этом методе атомы внутри анализируемого вещества заменяются стабильными изотопами, содержащими ¹³C или ^2H. Эти изотопы в дальнейшем включаются в предшественники, которые позже встраиваются в жирные кислоты, обозначая области, в которых они находятся. С помощью этих изотопов можно идентифицировать распределение и метаболизм липидов, так как они будут контрастировать на немаркированном фоне¹. Обычные масс-спектрометрические платформы не способны различать сигнал, поступающий от эндогенных молекул². Успех SIL требует использования аналитических инструментов со сверхвысоким разрешением. Жидкостная хроматография в сочетании со спектрометрией подвижности захваченных ионов с высоким разрешением, параллельным накоплением, последовательной фрагментацией-времяпролетной тандемной масс-спектрометрией (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) позволяет разделять меченые и немеченые виды². Преимущество анализа LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS заключается в том, что сигнал МС может быть отфильтрован по времени удержания (RT) и подвижности, что снижает потенциальную интерференцию эндогенных молекул, а также количественное определение и разделение всех желаемых веществ^. В TIMS ион сначала удерживается неподвижно против газомобильной фазы, а затем высвобождается в соответствии с его подвижностью. Это обеспечивает получение мобилограмм с высоким разрешением при работе при более низком напряжении по сравнению с более ранними приборами IMS³. Мобилограммы представляют собой графики зависимости массы заряда от времени дрейфа, которые можно использовать для различения соединений на основе времени их дрейфа и величины перекрытия⁴.

Использование дополнительной техники PASEF значительно увеличивает скорость секвенирования без ущерба для чувствительности⁵. Теория PASEF предполагает накопление ионов с последующим их последовательным высвобождением в порядке их подвижности. Это делается путем накопления ионов в параллельном выравнивании по их подвижности. Накопление таким образом предотвращает потерю ионов. Кроме того, выбор ионов-предшественников происходит одновременно с накоплением и высвобождением ионов. С помощью этого метода PASEF выбирает несколько прекурсоров последовательно во время каждого сканирования TIMS, а не отдельные предшественники за сканирование, типичное для прибора TIMS, в котором не используется PASEF. Когда ионы-предшественники одновременно накапливаются и высвобождаются с пиками в 2 мс в течение сканирования TIMS с частотой примерно 100 мс на кадр, сигнал усиливается более чем на один порядок, тем самым увеличивая отношение сигнал/шум³. Дополнение PASEF к TIMS повышает эффективность MS/MS. Поскольку TIMS-PASEF связан с MS/MS, возможна более эффективная фрагментация. В отличие от обычного детектирования МС/МС, сигнал прекурсора сжимается из TIMS-PASEF, и ионы фрагментов детектируются одновременно с временем элюирования TIMS и положением подвижности ионов предшественника³.

При получении данных с масс-спектрометра существуют опции в желаемом режиме сканирования. Данные, зависимые от сбора данных (DDA) выбирают ионы-предшественники из сканирования MS1 на основе их распространенности, прежде чем фрагментировать их и выполнить сканирование MS2. Этот режим сканирования фрагментирует как можно больше предшественников. Подход DDA является целенаправленным, и результаты будут зависеть от выбора ионов³. Тем не менее, DDA-PASEF часто имеет проблемы с воспроизводимостью между репликациями. В то время как DDA является отличным инструментом для целенаправленного анализа, сложные смеси имеют большие трудности при сборе данных⁶. Это связано с тем, что одновременно можно контролировать только небольшое количество ионов³. Независимый сбор данных (DIA) — это метод, при котором предварительно выбранные окна m/z фрагментируются независимо от их интенсивности, и все они сканируются в диапазоне⁷. В этом режиме сканирования целые ионные облака передаются из IMS на масс-спектрометр³. В исследованиях протеомики это приводит к количественному определению большего количества белков за более короткий промежуток времени по сравнению с DDA. Кроме того, DIA пропускает меньше значений m/z по сравнению с DDA. Таким образом, эта альтернатива продемонстрировала значительное улучшение воспроизводимости данных в соотношении сигнал/шум и лучшую количественную оценку по сравнению с DDA. В данной работе наша цель состоит в том, чтобы реализовать DIA в методе, описанном Tose et ^al.2. Мы улучшили воспроизводимость и интенсивность сигналов, получив дополнительную и более убедительную информацию о мобилизации, распределении и метаболизме липидов SIL в биологических образцах, используя преимущества сбора DDA и DIA.