안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적
Summary
여기에는 머무름 시간, 이동성 및 단편화를 사용하여 안정 동위원소 라벨링을 통해 지질 구조를 스크리닝하는 방법이 제시되어 있습니다.
Abstract
지질은 매우 다양하며, 지질 구조와 구성의 작은 변화도 중요한 생물학적 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 안정 동위원소 표지(SIL)는 지질 분포, 동원 및 대사 연구뿐만 아니라 새로운 지질 합성 연구에 여러 가지 이점을 제공합니다. SIL 기법을 성공적으로 구현하려면 내인성 분자에서 간섭을 제거해야 합니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 SIL 지질을 스크리닝하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 모기 난소 발달 중 lipid de novo 식별의 예가 표시됩니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 트랩 이온 이동성 분광법 및 질량 분석법을 사용하면 단일 스캔(<1시간)에서 단일 샘플에서 분리 및 지질을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 데이터 종속 수집 및 데이터 독립적 수집의 최근 개발을 활용하며, 이동성 트랩에서의 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용합니다. 지방산 사슬 수준에서 SIL을 측정하면 모기의 난소 발달 중 지질 역학의 변화를 알 수 있습니다. lipids de novo 구조는 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 확실하게 할당됩니다.
Introduction
지질 데이터를 분석할 때 안정 동위원소 표지(SIL)는 살아있는 유기체의 대사 경로를 평가하는 효과적인 방법입니다. 이 방법에서는 분석물 내의 원자가 13C또는 2H를 포함하는 안정 동위원소로 대체됩니다. 이 동위원소는 전구체에 추가로 통합되며, 이는 나중에 지방산 내에 내장되어 그들이 존재하는 영역을 표시합니다. 이러한 동위원소를 사용하면 지질의 분포와 대사를 식별할 수 있으며, 이는 표지되지 않은 배경1과 대조를 이룬다. 일반적인 질량 분석 플랫폼은 내인성 분자에서 오는 신호를 구별할 수 없습니다2. SIL의 성공을 위해서는 초고해상도 분석 도구를 사용해야 합니다. 고분해능 Trapped Ion Mobility Spectrometry-Parallel Accumulation-Sequential Fragmentation-Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 통해 표지된 종과 표지되지 않은 종을 분리할 수 있습니다2. LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 분석의 장점은 머무름 시간(RT) 및 이동성에 따라 MS 신호를 필터링할 수 있으므로 내인성 분자의 잠재적 간섭을 줄이고 원하는 모든 종의 정량화 및 분리를 줄일 수 있다는 것입니다2. TIMS에서 이온은 먼저 가스 이동상에 대해 고정되어 유지된 후 이동성에 따라 방출됩니다. 이는 이전 IMS 계측3보다 낮은 전압에서 작동하면서 고해상도 모빌로그램을 제공합니다. Mobilograms는 드리프트 시간에 대한 전하까지의 질량을 나타내는 플롯으로, 드리프트 시간과 중첩량을 기반으로 화합물을 구별하는 데 사용할 수 있습니다4.
추가적인 PASEF 기법을 사용하면 감도를 희생하지 않고 염기서열분석 속도가 크게 향상됩니다5. PASEF 이론은 이온의 축적 후 이온의 이동성 순서에 따라 순차적으로 방출되는 것을 포함합니다. 이것은 이온이 이동성에 평행하게 정렬되어 축적됨으로써 수행됩니다. 이러한 방식으로 축적되면 이온 손실이 방지됩니다. 또한, 전구체 이온 선택은 이온의 축적 및 방출과 동시에 발생합니다. 이 방법을 통해 PASEF는 PASEF를 사용하지 않는 TIMS 기기의 일반적인 스캔당 개별 전구체가 아닌 각 TIMS 스캔 중에 여러 전구체를 직렬로 선택합니다. 전구체 이온이 프레임당 약 100ms의 TIMS 스캔 내에서 2ms 피크로 동시에 축적 및 방출되면 신호는 한 자릿수 이상 증폭되어 신호 대 잡음비3이 증가합니다. TIMS에 PASEF를 추가하면 MS/MS의 효율성이 향상됩니다. TIMS-PASEF는 MS/MS와 결합되어 보다 효율적인 단편화가 가능합니다. 기존의 MS/MS 검출과 달리 TIMS-PASEF에서 전구체 신호가 압축되고 단편 이온이 전구체3의 TIMS 용리 시간 및 이온 이동도 위치로 동시에 검출됩니다.
질량 분석기에서 데이터를 수집할 때 원하는 스캔 모드 옵션이 있습니다. DDA(Data Dependent Acquisition)는 MS1 스캔에서 전구체 이온을 단편화하고 MS2 스캔을 수행하기 전에 이온의 함량을 기준으로 선택합니다. 이 스캔 모드는 가능한 한 많은 전구체를 단편화합니다. DDA 접근법은 표적화되며 결과는 이온 선택3에 따라 달라집니다. 그러나 DDA-PASEF는 종종 반복 횟수 간의 재현성에 문제가 있습니다. DDA는 집중 분석에 탁월한 도구이지만, 복잡한 혼합물은 데이터 수집에 더 큰 어려움이 있다6. 이는 소량의 이온만 동시에 모니터링할 수 있기 때문입니다3. DIA(Data Independent Acquisition)는 m/z의 사전 선택된 창을 강도와 독립적으로 단편화하고 모두범위 7 내에서 스캔하는 방법입니다. 이 스캔 모드를 사용하면 전체 이온 클라우드가 IMS에서 질량 분석기3으로 전송됩니다. 단백질체학 연구에서는 DDA에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 양의 단백질을 정량화할 수 있습니다. 또한 DIA는 DDA에 비해 더 적은 m/z 값을 누락합니다. 따라서 이 대안은 DDA보다 신호 대 잡음비에서 데이터 재현성이 크게 향상되고 정량화가 더 우수함을 보여주었습니다. 본 연구에서 우리의 목표는 Tose et al.2가 보고한 방법에 따라 DIA를 구현하는 것입니다. 신호의 재현성과 강도를 개선하여 DDA 및 DIA 획득을 활용하여 생물학적 샘플의 SIL 지질 동원, 분포 및 대사에 대한 더 확실하고 명확한 정보를 얻었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 사용을 평가할 때 DIA-PASEF 및 MS/MS 매개변수가 해당 트리글리세라이드에 적용되는지 확인하는 것이 중요합니다. 특히, 이동성 창과 창 너비는 트리글리세리드의 패턴을 따라야 합니다. 이는 DDA 방법을 사용하여 이전 실행으로 확인할 수 있습니다. 내부 표준물질에서 트리글리세라이드를 추적할 때 DIA 설정을 위한 창은 사전 식별된 모든 관심 분자를 포괄해야 합니다. 창은 모두 동일…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 초기 분석법 개발 과정에서 Cesar Ramirez 박사의 기여를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 체코 과학 재단(Czech Science Foundation)이 미네소타주에 R21AI167849한 NIAID 보조금 FGN의 프로젝트 22-21244S의 지원을 받았습니다.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
Riferimenti
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