Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

1. Plasmide-acquisitie OPMERKING: Dit protocol zal een gen van belang (GOI) klonen in een ITR-bevattend plasmide met een cytomegalovirus (CMV)-promotor en een SV40-polyadenyleringssequentie (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Dit plasmide kan echter zonder verder klonen worden gebruikt om rAAV’s te produceren, met een handige dubbele EGFP- en Luciferase-reporter. Plasmiden met verschillende regulerende elementen of voor verschillende toepassingen, zoals voor op CRISPR gebaseerde experimenten, zijn online beschikbaar en zullen vergelijkbare kloonstappen volgen als hieronder (zie discussie voor aanvullende kloonstappen). Bovendien kunnen rep/cap- of transplasmiden voor verschillende serotypen worden gebruikt – dit protocol gebruikt rep/cap voor AAV-serotype 2. Koop bacteriële steken die een ITR-bevattend cis-plasmide , een adenovirus-helperplasmide, een rep/cap-plasmide en een plasmide met een Indonesische overheid bevatten. Streep de bacteriën op individuele agarplaten die antibiotica bevatten die specifiek zijn voor de resistentie van elk plasmide. Incubeer de bacteriën ‘s nachts bij 30 °C om te groeien.OPMERKING: Als een plasmide met een Indonesische overheid niet direct beschikbaar is voor aankoop, kan een synthetisch DNA-fragment (zie materiaaltabel) online worden gekocht. Bovendien kan een synthetisch DNA-fragment worden gebruikt om desgewenst het hele PCR-proces over te slaan. Kies een enkele kolonie van elk bord en kweek in 3 ml Luria Bertani (LB)-buffer aangevuld met het bijbehorende antibioticum bij 30 °C gedurende een nacht, schuddend bij 180 tpm. Breng 1 ml van de bacteriën over in een steriele erlenmeyer van 250 ml met 50 ml LB-buffer, aangevuld met het bijbehorende antibioticum. Schud bij 30 °C, 180 rpm gedurende een nacht. Breng de bacteriën over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 20 minuten op 3.000 x g, kamertemperatuur. Gooi supernatant weg. Isoleer het plasmide met behulp van een endotoxine-arme of -vrije midiprep-kit volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: ITR’s zijn onstabiele structuren. Om ITR-deleties of -mutaties te voorkomen, moeten bacteriële cellen worden gekweekt bij 30 °C om de celdeling te vertragen en fouten in de replicatie te beperken. Om de plasmideopbrengst en zuiverheid te verhogen, is een midiprep- of maxiprep-kit ideaal. Het wordt aanbevolen om een endotoxine-arme of -vrije kit te gebruiken om stroomafwaartse endotoxinebesmetting van cellen te verminderen. Het is niet nodig om plasmide-isolatie uit te voeren in een laminaire stromingskap, aangezien besmetting van het plasmidepreparaat niet waarschijnlijk is als het op een standaardbank wordt uitgevoerd. 2. Klonen van interessant gen in AAV ITR-bevattend plasmide Open de plasmidekaart met de Indonesische overheid in software voor het bekijken van DNA.OPMERKING: De volledige cassette, inclusief de ITR’s, mag niet groter zijn dan 4.9 kb vanwege fysieke verpakkingsbeperkingen van de capside. Bovendien kan PCR-amplificatie niet worden bereikt via ITR’s vanwege secundaire structuren. Als zodanig wordt Gibson-assemblage niet aanbevolen voor het klonen van rAAV-transgenen.Klik op het tabblad Sequentie om de volledige sequentie van het plasmide weer te geven. Scroll naar het 5′ meest gelegen gebied van de GOI-sequentie en klik op de eerste nucleotide terwijl je naar binnen sleept in de richting van het genlichaam om een voorwaartse primer te maken. Laat los zodra een smelttemperatuur (Tm) van ~55 °C is bereikt. Klik op Primer doorsturen. Voeg handmatig de sequentie voor een EcoRI-restrictieplaats (5′ GAATTC 3′) toe aan het 5′ meest uiteinde van de primersequentie. Voeg bovendien zes extra willekeurige basen toe aan het einde van 5′ van deze beperkingsplaats om het enzym efficiënt te laten interageren met het DNA. Klik op Primer toevoegen. Zie figuur 2 voor een representatief voorbeeld. Controleer de primer om er zeker van te zijn dat deze geen haarspelden of primerdimeren kan vormen (behalve de restrictieplaats die palindromisch is). Als er haarspeldbochten ontstaan, verander dan de willekeurige volgorde van de zes extra bases. Zorg er bovendien voor dat de primer nergens anders op het plasmide bindt. Herhaal de stappen om een omgekeerde primer te maken op het 3′ meest gelegen gebied van de Indonesische overheid naar het genlichaam. Klik op Reverse Primer en voeg een NotI-beperkingssite toe (5′ GCGGCCGC 3’).OPMERKING: De Indonesische overheid mag geen EcoRI- of NotI-restrictieplaatsen bevatten – als dat het geval is, moeten andere restrictie-enzymen worden gebruikt. Amplificeer de Indonesische overheid in een PCR-reactie van 50 μl. Gebruik de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 1.Plaats de reactie in een thermocycler en volg de cyclusparameters uit tabel 2 voor de programmering. Als primers een andere T m hebben, gebruik dan de onderste Tm voor het programma. Controleer de amplificatie van het juiste PCR-fragment door 1 μL gelladende kleurstof (6x) toe te voegen aan 5 μL PCR-reactie. Voer een DNA-ladder en het PCR-mengsel uit op een 0,8% agarosegel met ethidiumbromide en visualiseer met UV-licht.LET OP: Ethidiumbromide is een bekend mutageen. Als er een enkele, specifieke band op de gel verschijnt, reinig dan het resterende PCR-product in de PCR-stripbuis met behulp van een op kolommen gebaseerde PCR-reinigingskit volgens de instructies van de fabrikant. Als er meerdere banden verschijnen (als gevolg van niet-specifieke versterking), snijd dan de gewenste band weg en zuiver het DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Verteer het gezuiverde PCR-product en het pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-ruggengraatplasmide in een reactie van 50 μl met de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 3 gedurende 1 uur bij 37 °C. Een grotere hoeveelheid pAAV-plasmide-DNA is vereist vanwege het verwachte inefficiënte herstel na gelextractie.OPMERKING: De gebruikte restrictie-enzymen zijn high-fidelity (HF) versies. Regular NotI kan niet worden gebruikt met CutSmart buffer. Als er verschillende enzymen worden gebruikt, kan een verschillende incubatietemperatuur en buffer nodig zijn.Zuiver het verteerde PCR-product met een op kolommen gebaseerde PCR-reinigingskit volgens de instructies van de fabrikant. Bereid het verteerde pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 ruggengraatplasmide voor op gelelektroforese door 10 μL gelladende kleurstof (6x) toe te voegen aan 50 μL verteringsreactie. Laad een DNA-ladder, verteringsreactie en 250 ng onverteerd plasmide (negatieve controle) op een 0,8% agarosegel met ethidiumbromide met brede tandputjes. Visualiseer met UV-licht, snijd het gewenste fragment weg (~4,5 kb) en zuiver het DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Ligate het verteerde PCR-product en verteerde pAAV-ruggengraatplasmide in een ligatiereactie van 20 μL met de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 4. Gebruik formule 1 om de benodigde hoeveelheid PCR-producten te berekenen. Gebruik doorgaans een molaire verhouding van 3:1 van PCR-product (insert) tot ruggengraat (pAAV), met een massa van 50 ng ruggengraat.Formule 1 Voer een negatieve controle uit door het PCR-product te vervangen door water. Incubeer ligatiereacties bij 16 °C ‘s nachts of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Ontdooi een injectieflacon met competente, recombinatie-deficiënte bacteriële cellen (zoals Stbl3-cellen) op ijs en plaats 50 μL in een buisje van 1,5 ml. Voeg 3 μL van de ligatiereactie rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.OPMERKING: ITR’s zijn onstabiele structuren en vereisen daarom recombinatie-deficiënte bacteriestammen om ITR-deletie en recombinatiegebeurtenissen te beperken. DH5α-cellen kunnen met tussenpozen worden gebruikt voor vermeerdering (een of twee keer), maar worden niet aanbevolen voor langdurig gebruik. De ITR-integriteit moet regelmatig worden gecontroleerd na de midiprep-zuivering.Geef de bacteriën een warmteschok in een waterbad van 42 °C gedurende 30 seconden en breng ze vervolgens onmiddellijk over op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 200 μL LB-buffer toe en schud gedurende 1 uur bij 30 °C, 180 rpm. Verdeel 125 μl van het mengsel over een agarplaat met het bijbehorende antibioticum en incubeer gedurende een nacht (~18 uur) bij 30 °C. Kies meerdere klonen en plaats ze in een steriele plastic kweekbuis met 3 ml LB met het bijbehorende antibioticum. ‘s Nachts schudden bij 30 °C, 180 tpm.OPMERKING: Om ITR-deleties of -mutaties te voorkomen, moeten bacteriële cellen worden gekweekt bij 30 °C om de celdeling te vertragen en fouten in replicatie te beperken. Bovendien moeten kleinere kolonies worden geplukt, omdat kolonies zonder ITR’s een groeivoordeel kunnen hebben ten opzichte van andere. Pipetteer 1,8 ml van elke cultuur in een buis van 2 ml en centrifugeer op 6.000 x g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur. Isoleer het DNA met behulp van een miniprep-kit. Bewaar de resterende 1,2 ml cultuur bij 4 °C. Controleer de juiste klonen door middel van DNA-sequencing of diagnostische restrictie-enzymvertering.OPMERKING: Sanger-sequencing van de insert wordt aanbevolen, maar processiviteit door middel van ITR’s is niet haalbaar met standaardmethoden. ITR’s moeten worden geverifieerd door middel van restrictiesamenvatting, zoals hieronder beschreven. Voeg 50 ml LB-buffer met het bijbehorende antibioticum toe aan een steriele erlenmeyer van 250 ml. Voeg 500 μl van de resterende cultuur toe aan de kolf en schud bij 30 °C, 180 rpm tot een OD600 van 0,2-0,5 is bereikt (~18 uur). Breng de bacteriën over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 3.000 x g, 4 °C. Isoleer het DNA met behulp van een endotoxine-arme of -vrije midiprep-kit. Controleer de ITR-integriteit met 20 μL diagnostisch restrictie-enzymdigestaat met behulp van XmaI (of SmaI). Bereid een reactie voor met 500 ng plasmide, 0,5 μL enzym en 1x buffer; incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Voer de reactie uit op een 0,8% agarose-gel. Als ITR’s intact zijn, geeft de spijsvertering een band van ~2,9 kb en een andere band ter grootte van de cassette. Als deze duidelijke band niet in acht wordt genomen, is de ITR mogelijk niet intact en moet het klonen opnieuw worden uitgevoerd.OPMERKING: Plasmiden die XmaI (of SmaI) restrictieplaatsen bevatten (naast die in de ITR’s) zullen extra banden op de gel hebben. Figuur 2: Representatief voorbeeld voor primerontwerp. Voorwaarts en achterwaarts primerontwerp voor een mScarlet-transgen (representatief voorbeeld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aantal Bestanddeel X μL Sjabloon DNA (25 ng) 1 μL F primer (10 μM) 1 μL R primer (10 μM) 1 μL dNTP (10 mM) 10 μL Phusion Buffer (5x) 1 μL Phusie Polymerase X μL Water 50 μL Eindvolume Tabel 1: PCR-amplificatiereagentia. De benodigde componenten voor een succesvolle PCR-reactie. Stap Temperatuur Tijd Initiële denaturatie 98 °C 1 minuut 30 cycli 98 °C 10 seconden Tm van Primer jaren ’30 seconden 72 °C 30 s per KB Laatste verlenging 72 °C 10 min Houden 4 °C Onbeperkt Tabel 2: PCR-amplificatieprogrammering. De vereiste cyclusparameters voor een succesvolle PCR-reactie. Aantal Bestanddeel X μL PCR-product (1 μg) of pAAV-plasmide (3 μg) 5 μL Buffer (10x) 1 μL EcoRI-HF 1 μL NotI-HF X μL Water 50 μL Eindvolume Tabel 3: Reagentia voor de spijsvertering. De benodigde componenten voor een succesvolle verteringsreactie. Aantal Bestanddeel X μL Invoegen (X ng) X μL Ruggengraat (50 ng) 2 μL T4 DNA Ligase Buffer (10x) 1 μL T4 DNA-ligase X μL Water 20 μL Eindvolume Tabel 4: Ligatiereagentia. De benodigde componenten voor een succesvolle ligatiereactie. 3. Vectorproductie met drievoudige plasmidetransfectie OPMERKING: De volgende waarden zijn geoptimaliseerd voor een enkel putje van een plaat met 6 putjes die een uiteindelijk ruw bereidingsvolume van 2 ml oplevert. Alle waarden kunnen 10x worden opgeschaald voor een plaat van 15 cm die een eindvolume van 20 ml oplevert of 4x worden verkleind voor een plaat met 24 putjes en een eindvolume van 500 μL. Maak een voorraad polyethyleeniminehydrochloride (PEI) MAX van 1 μg/μL door 100 mg PEI MAX op te lossen in 100 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan naar 7,1 met NaOH. Filter steriliseer het mengsel met een filter van 0,22 μm en vries aliquots van 1 ml in bij -20 °C voor langdurige opslag. Eenmaal ontdooid, bewaar het reagens gedurende 1 maand bij 4 °C. Zaad 3 x 10 5 HEK293 of HEK293T cellen in een plaat met 6 putjes met voorverwarmde Dulbecco’s gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM,4,5 g/L glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Groei tot ~75%-90% confluentie in een incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2 (Figuur 3).OPMERKING: Er is waargenomen dat cellen gekweekt met penicilline/streptomycine (P/S) de opbrengst van de vectorproductie verminderen. Het gebruik van de juiste steriele techniek omzeilt de noodzaak om P/S te gebruiken, en daarom wordt aanbevolen om HEK293-cellen niet te kweken met antibioticum20. Als P/S vereist is bij stroomafwaartse transducties, wordt aanbevolen om na de oogst P/S toe te voegen aan de ruwe bereiding. Bereid in een buisje van 2 ml een mengsel met 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotype 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 en serumvrije (SF) DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvaat) in een totaal volume van 100 μl (zie aanvullende tabel 1 voor gemakkelijke berekeningen). Bereid een negatieve controle voor in een apart buisje door pRep/Cap te vervangen door een niet-verwant plasmide. De negatieve controle houdt rekening met onverpakte pAAV.GOI-plasmide dat aanwezig is in het ruwe preparaat en dat mogelijk cellen zou kunnen transfecteren tijdens transductie, hoewel zeldzaam.OPMERKING: Endotoxine-laag of -vrij maxiprep of midiprep-plasmide is ideaal voor drievoudige transfectie en produceert over het algemeen een hogere titervector in vergelijking met miniprep-DNA, hoewel miniprep-DNA kan worden gebruikt voor snelle en vuile voorlopige tests. Voeg 5,2 μL PEI MAX toe aan het plasmidemengsel; dit is een plasmide:PEI-mengsel met een verhouding van 1:1. Meng goed door 10-15 keer te pulseren op een vortexmixer die op 7 staat. Als er meerdere vectorpreparaten worden geproduceerd, voeg dan PEI toe aan elk plasmidemengsel met gespreide tijdsintervallen van 1 minuut (d.w.z. preparaat 1 bij t = 0 min, preparaat 2 bij t = 1 min, enz.) om voldoende timing te hebben om putjes op te zuigen en de reactie in de volgende stappen te verdunnen.OPMERKING: Er is waargenomen dat een verhouding van 1:1 plasmide:PEI optimaal is. Individuele gebruikers kunnen deze verhouding echter optimaliseren voor maximale efficiëntie. Raadpleeg de discussie voor het uitvoeren van PEI-optimalisatie (zie ook aanvullende tabel 2). Incubeer elk buisje gedurende precies 15 minuten en verdun de reactie vervolgens met 1,9 ml SF DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvaat) voor een eindvolume van 2 ml. Pipetteer voorzichtig 2x om te mengen. Overmenging verstoort plasmide/PEI-complexen en resulteert in een lagere transfectie-efficiëntie. Zuig media uit de put en voeg het plasmide:PEI-mengsel voorzichtig toe aan de zijkanten van de put om cellulaire loslating te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 °C en 5% CO2 . Cellyse en -onthechting tijdens de incubatie is een normaal proces van rAAV-productie (Figuur 4). Figuur 3: HEK293-cellen klaar voor transfectie. De ideale samenvloeiing (75%-90%) van HEK293-cellen die nodig zijn voor drievoudige plasmidetransfectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: HEK293 cellen na transfectie. Het verschijnen van HEK293-cellen voor en na 1, 2 of 3 dagen na transfectie met pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 en 1:1 verhouding van plasmide:PEI. Schaalbalken: 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Oogsten van preparaten voor ruwe vectoren Vries de hele plaat van getransfecteerde cellen gedurende 30 minuten bij -80 °C in, gevolgd door een dooi gedurende 30 minuten bij 37 °C. Herhaal dit voor een totaal van drie vries-/dooicycli. Verwijder het deksel niet – de plaat moet van binnen steriel blijven. Platen kunnen op -80 °C blijven totdat ze klaar zijn om door te gaan naar de volgende stappen.NOTITIE: Een niet-bevochtigde incubator werkt het beste voor ontdooien, waardoor condensatie aan de buitenkant van platen tot een minimum wordt beperkt, wat kan leiden tot onbedoelde besmetting. Voer de volgende twee stappen uit in een laminaire stromingskap met behulp van aseptische technieken. Meng elk putje door te pipetteren om een maximale verstoring van de cellen te garanderen. Breng lysaat over in een buis van 2 ml en centrifugeer gedurende 15 minuten op 15.000 x g, kamertemperatuur om celresten te verwijderen. Breng het supernatans voorzichtig over in een nieuw buisje van 2 ml. Dit ruwe preparaat kan onmiddellijk worden gebruikt zonder titratie of zuivering. Vector kan enkele maanden bij 4 °C of jarenlang bij -20 °C worden bewaard.OPMERKING: Indien nodig kunnen titers worden berekend door middel van kwantitatieve PCR (qPCR) door het aantal vectorgenomen (VG) in DNase-resistente deeltjes te kwantificeren. Als zodanig worden titers gegeven in eenheden van VG/ml. Vector die enkele maanden bij 4 °C wordt bewaard, moet vóór gebruik opnieuw worden getitreerd, omdat vector buiswanden kan samenvoegen en/of binden, waardoor de titer van het preparaat wordt verminderd. 5. Transductie Plaat het gewenste celtype (bijv. Huh7) in een plaat met 96 putjes bij een doelconfluentie van 50%-75%, afhankelijk van de duur van de transductie. Een grotere samenvloeiing kan leiden tot een verminderde AAV-transductie-efficiëntie. Voeg vector (bijv. CMV.mScarlet) toe aan cellen zonder de titer van het ruwe preparaat te kennen voor toepassingen waarbij de dosis niet relevant is, zoals het testen van een panel van capsiden voor transductie in een nieuw celtype. Voer een 1:3 verdunningsreeks van het ruwe preparaat uit in serumvrije (SF) media om de optimale hoeveelheid vector te verkrijgen die nodig is voor de toepassing. Zuig media op van een plaat met 96 putjes en voeg 50-100 μL verdund ruw preparaat toe aan de putjes. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO2 .OPMERKING: Serum kan antilichamen bevatten die de AAV-vector kunnen neutraliseren en de transductie-efficiëntie kunnen verminderen. Serum kan echter worden gebruikt tijdens transductie voor gevoelige celtypen. Verwijder de vector na 48 uur posttransductie (hpt) en was de cellen eenmaal met voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vectoren kunnen ook worden verwijderd en vervangen door serumbevattende media zodra 2 hpt voor gevoelige celtypen. Voer voor veel toepassingen ‘s nachts incubatie uit om cellen te transduceren en ‘s ochtends putjes te vervangen door verse serumbevattende media. Robuuste celtypen, zoals Huh7 en U2-OS, hoeven niet van media te worden gewisseld. Beëindig de transductie door cellen gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA) te fixeren. Afhankelijk van de toepassing kunnen ook verschillende afsluitmethoden worden gebruikt (bijv. lysis). Voor de meeste celtypen vindt piekexpressie plaats bij 48 hpt en is dus een gemeenschappelijk experimenteel eindpunt. 6. Variaties op de transductiemethode per celtype OPMERKING: Verschillende celtypen vereisen verschillende kweekomstandigheden. Daarom moet de toevoeging van vector voor transductie worden geoptimaliseerd op basis van de behoeften van het celtype. Hieronder staan zeer specifieke transductieprotocollen voor de celtypen die in de representatieve resultaten zijn opgenomen, ter illustratie van enkele variaties van transductieprotocollen die een onderzoeker mogelijk voor zijn eigen behoeften wil proberen. Organoïden van de dunne darm van muizenLeid muizen dunne darm organoïden (mSIO’s) af van een dunne darm crypte prep van C57BL/6J muizen. Veranker organoïden in 90% basale membraanmatrix en kweek in platen met 24 putjes die ofwel organoïde groeimedium (zonder antibiotica) of pre-transductiemedium bevatten (50% Wnt3a-geconditioneerd medium [intern geproduceerd met behulp van L Wnt-3A-cellen in organoïde groeimedium], 10 mM nicotinamide, 10 μM ROCK-remmer en 2,5 μM CHIR99021) gedurende één passage (5-7 dagen) vóór transductie bij 37 °C en 5% CO2. Spoel de organoïden voorafgaand aan de transductie met D-PBS, verstoor de koepels van de basale membraanmatrix door te pipetteren en dissocieer de organoïden in kleine celclusters door ze gedurende 10 minuten bij 37 °C in dissociatiemedium te incuberen en verder te pipetteren. Stop het celdissociatieproces door 5% FBS toe te voegen aan DMEM/F-12 met 15 mM HEPES, celclusters over te brengen in centrifugebuizen en celclusters op te vangen door 5 minuten te centrifugeren bij 1000 x g, kamertemperatuur. Resuspendeer de celclusters in transductiemedium (pre-transductiemedium met 10 μg/ml polybreen of organoïde groeimedium met 10 μg/ml polybreen) en breng over in platen met 48 putjes, gevolgd door de toevoeging van AAV-ruwe preparaten ter verpakking CMV.mScarlet voor transductie. Voer de transductie van organoïden uit door de plaat gedurende 1 uur te centrifugeren bij 600 x g en 37 °C en vervolgens nog eens 6 uur bij 37 °C te incuberen. Verzamel getransduceerde organoïden in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten op 1000 x g, kamertemperatuur, en zet op ijs. Na verwijdering van het supernatant de getransduceerde organoïden resuspenderen in 90% basaalmembraanmatrix in pre-transductiemedium of organoïde groeimedium en zaaddruppeltjes van 20 μL in een putje van een voorverwarmd kamerglas. Na een incubatietijd van 10 minuten in de incubator de druppel inbedden in 350 μl voortransductiemedium of organoïde groeimedium en incuberen bij 37 °C in de incubator. Bepaal de transductie-efficiëntie 2-5 dagen na transductie door de getransduceerde organoïden af te beelden op een confocale microscoop en schat het percentage rode fluorescerende cellen per organoïde. BeWo-cellen24 uur vóór transductie, plaat humaan placenta-choriocarcinoom BeWo-cellen op 10.000 cellen per putje van 96-wells plaat. Verdun ruwe AAV-preparaten die CMV.mScarlet verpakken tot 1:1 in serumvrij F12-K BeWo-medium tot een totaal volume van 50 μL per putje. Zuig het medium op uit het putje en vervang het door 50 μL verdunde AAV per putje. Incubeer cellen bij 37 °C ‘s nachts (~18 uur) en voeg vervolgens 100 μL F12-K BeWo-medium met 10% FBS toe om het totale volume op 150 μl te brengen. Incubeer cellen gedurende nog eens 6 uur voor een totaal van 24 uur posttransductie (hpt). Kleuring voor beeldvorming levende cellen gedurende 30 minuten met Hoechst-kleurstof in F12-K-medium en vervang het medium vervolgens door fenolvrije DMEM met 10% FBS, 1x glutamax-supplement en 1x natriumpyruvaatsupplement voor beeldvorming. Beeldvorming van levende cellen uitvoeren op een confocale microscoop met behulp van DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry- (voor mScarlet-beeldvorming) filtersets met 37 °C en 5% CO2. Hepa1-6 en Huh7 cellenPlaat muizen Hepa1-6 levercellen en menselijke Huh7 levercellen in DMEM (4,5 g/L glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat, 10% FBS) bij 5.000 cellen per putje van een plaat met 96 putjes 24 uur voor transductie. Voeg 50 μl onverdunde ruwe AAV-preparaten ter verpakking van CMV.mScarlet rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C. Was de cellen eenmaal in PBS, fixeer ze in 4% PFA en kleur ze gedurende 10 minuten met Hoechst-kleurstof. Voer beeldvorming uit op een confocale microscoop met behulp van de filtersets DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry (voor mScarlet-beeldvorming). C2C12- en HSkMC-cellenPlaat ongedifferentieerde muizen C2C12-myoblasten en ongedifferentieerde myoblasten van menselijke primaire skeletspiercellen (HSkMC) bij 5.000 cellen per putje van een plaat met 96 putjes, 72 uur vóór transductie. Verdun ruwe AAV-preparaten die CMV.mScarlet verpakken tot 1:1 in DMEM (4,5 g/L glucose, Penn/Streptokokken, 20% FBS) voor C2C12-myoblasten of groeimedia voor skeletspiergroeimedia voor HSkMC-myoblasten. Differentieer HSkMC-myoblasten naar myotubes door de media te veranderen in differentiatiemedia. Incubeer myoblasten en myotubes in verdunde AAV-preparaten gedurende 24 uur bij 37 °C. Kleuring van levende cellen met Hoechst-kleurstof gedurende 10 minuten en beeld af met een confocale microscoop met behulp van de filtersets DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry (voor mScarlet-beeldvorming).