土壌生物の活性による鉱物風化促進実験装置の設計と構築

以下では、セットアップのさまざまな部分を構築するための詳細なプロトコルが、18列のシステムを考慮して説明されています。 1. 柱を固定するフレームの構築 浸出水を集めるための灌漑システム、柱、漏斗、パイプを保持するためのアクリル板を準備します。63cm×67cmのアクリル板(アクリル板1〜3)3枚と、45cm×56cmのアクリル板(アクリル板4)1枚をカットします。 各アクリル板に、以下の手順に従って18個の穴を開けます。アクリル板1-天板:後で灌漑システムのチューブを挿入するために直径0.7 cmの穴を開けます。 アクリル板2 – 天板から2番目:柱を後で挿入するために直径8cmの穴を開けます(図2)。 アクリル板3-底板から2番目:後で漏斗を挿入するために直径1.2cmの穴を開けます。 アクリル板4-底板:直径1.2cmの穴を開けて、浸出液をジェリカンに運ぶプラスチックパイプを後で挿入します。 さらに、アクリル板1〜3の四隅に直径1.1cmの穴を1つ、側面に直径1.1cmの穴を1つ開けて、ステンレス鋼のネジを差し込みます。 アクリル板ごとに、ラベルプリンターを使用して列の番号(1〜18)をプラスチックラベルに印刷し、それぞれの穴の下に貼り付けます。注意: アクリルプレート2、3、および4に18列の数に応じてラベルを貼り付けると、設置中にセットアップのさまざまな部分をそれぞれの場所に配置するのに役立ちます。 アクリル板を固定するには、ステンレス鋼板とネジを使用してください。図3に示すデザインに従って作られた、寸法63.6 cm x 67.3 cm x 4 cm、厚さ1.5 mmのオーダーメイドのステンレス鋼板を取ります。 各ステンレス鋼板のすべての角と側面に直径1.1cmの穴を開けます。 ステンレス鋼のネジ(長さ50 cm)を取ります。 アクリル板1(灌漑管)、2(柱)、3(漏斗)の順番でステンレスネジにアクリル板を差し込みます。各コーナーに2つの六角ナットと2つのワッシャーキャリアを使用して、アクリルプレートを所定の位置に保ちます。注意: 後でさまざまなコンポーネントを挿入できるように、各アクリルプレートの間に十分な距離を保ってください。アクリル板1からアクリル板2までは~19.5cm、アクリル板2からアクリル板3までは~10.5cm、アクリル板3からアクリル板4までは~16.5cmの距離を保ってください。 各コーナーに2つの六角ナットと2つのワッシャーキャリアを使用して、上部と下部のステンレス鋼板をステンレス鋼のネジに取り付けます。 冷蔵庫システムの構築が完了したら、システム全体を冷蔵庫の上に置きます。 図2:柱が配置されているアクリル板2の設計の概略上面図。番号付きのラベルは、対応する列を配置する必要がある場所を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:ステンレス板のデザイン。 (A,B)トッププレート。(C、D)底板。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 2. 浸出水回収用冷凍システムの構築 冷蔵庫を設置してジェリカンを入れます。冷蔵庫から両方の蓋を取り外し、裏蓋をアクリル板4に交換します。注意: 一度取り付けたら、このアクリル板を取り外すことはできません。冷蔵庫内で作業するには、前蓋を持ち上げて取り外します。 冷蔵庫をクライメートチャンバーに置き、プラグを差し込みます。 冷蔵庫の温度を4°Cに設定し、冷蔵庫内にデータロガーを置きます。 前蓋で冷蔵庫を閉じます。 データロガーによって記録されたデータを一晩監視します。温度が希望の値から逸脱した場合は、冷蔵庫の底にある格子を取り外して温度を調整してください。希望の温度に達するまで、この手順を繰り返します。 ポリ塩化ビニル(PVC)パイプを使用して、漏斗をジェリカンに接続します。18本の塩ビパイプ(内径0.8 cm)を適切な長さにカットして、それぞれの番号に応じて異なる漏斗から各ジェリカンに到達します。注意: 長さは、最短チューブの最小38cmから最長チューブの最大81cmまでさまざまです。 最初に使用する前に、パイプを半水ですすいでください。それ以外の場合は、炭酸沈殿物を除去するために30 gのクエン酸生成物を希釈した50 Lの水に4日間浸します。その後、パイプをデミウォーターで再度すすぎます。注意:クエン酸の製品が安全に使用できる場合でも、適切な保護対策を講じて、目との接触や皮膚との長時間の接触を避けてください。注:超純水が利用可能な場合は、半水の代わりに使用することをお勧めします。 パイプを24時間風乾させます。 パイプをアクリル板4にそれぞれの番号に従って挿入します。 漏斗を設置して、浸出液をジェリカンに向けます。最初の使用前に18個の漏斗をエタノールで拭きます。それ以外の場合は、PVCパイプに記載されているのと同じ手順に従ってください。注意: エタノールは可燃性であり、目、皮膚、気道の炎症、めまい、浅い呼吸を引き起こす可能性があります。エタノールは、摂取、吸入、または皮膚吸収によって有害です。 漏斗をアクリル板3に挿入し、番号に従ってそれぞれのパイプに接続します。 浸出水を集めるためにジェリカンを設置します。容量10Lの高密度ポリエチレン(HDPE)ジェリカンを10個、容量5LのHDPEジェリカンを8個用意します。注:5 Lのジェリカンは低い灌漑速度に使用され、10 Lのジェリカンは高い灌漑速度に使用されます( 表1を参照)。HDPEのジェリカンは、この材料が化学的に不活性であるため、選択されます。 50 mLの食器洗い機用石鹸を10 Lの水道水で希釈します。ジェリカンをこの溶液で一度、水道水で一度、デミウォーターで一度すすぎます。他の使用の前に、このクリーニング手順を繰り返してください。注:超純水が利用可能な場合は、半水の代わりに使用することをお勧めします。 ジェリカンを24時間風乾させます。 直径1.2cmの各ジェリカンの蓋に穴を開けてプラスチックチューブを挿入し、浸出液を収集します。 それぞれの蓋でジェリカンを閉じます。 図4に示すスキームに従って、冷蔵庫内のジェリカンを2層に置き、同時にチューブをジェリカンに接続します。 図4:冷蔵庫内のジェリカンを底層(左側)と上層(右側)の2層に積み重ね た概略図。黒い円は蓋の方向を示し、青と緑の長方形はそれぞれ10Lと5Lのジェリカンを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 3. 柱とメッシュシステムの構築 塩ビカラムをメソコスモスとして使用し、岩石粉末や土壌生物をインキュベートします塩ビ管を長さ15cmの18列に切ります。 カラムを初めて使用する場合は手順 1 に従ってクリーニングし、それ以外の場合は手順 2 に従ってカラムをクリーニングします。手順 1:カラムを半水に48時間浸します。注:超純水が利用可能な場合は、半水の代わりに使用することをお勧めします。 カラムをデミウォーターですすいでください。カラムを乾燥させ、エタノールで拭きます。 ラベルを使用するか、チューブ上のマーカーを使用して直接列に番号を付けます。 手順 2:カラムを水に1日浸します。 ブラシを使用して、実験の残骸をこすり落とします。 カラムを乾燥させ、エタノールで拭きます。 中央のリングを使用して、漏斗の上にカラムを保持します。3Dプリンターでリング(直径8.5cm、厚さ0.5cm)をデザインします。柱の安定性を高めるために、アクリル板2の穴に収まる別のリングを底に描いてください(図5)。 熱可塑性ポリウレタン(TPU)95A材料を使用した3Dプリンターで18個のリングをプリントします。 漏斗から2〜3 cm上にカラムを維持する位置で、カラムにリングを置きます。 カラムの下部にメッシュシステムを使用して浸出水をろ過し、粒子の損失を最小限に抑えます。メッシュ(孔径10μmと20μm)を12cm×12cmの正方形にカットします。 メッシュを超純水に2日間浸します。メッシュを風乾させます。 カラムの下部に、20 μmの最初のメッシュを配置します。20μmのメッシュの上に1cmのプラスチックビーズの層を置きます。 20μmのメッシュとプラスチックビーズの層の上に、10μmの2番目のメッシュを置きます。 メッシュシステムを所定の位置に保つために、2つのケーブルタイを配置します。結束バンドを締め、端を切ります。メモ: 図 6 は、コラムの下部にメッシュシステムを組み立てる方法を示しています。 ミミズの逃げないように上部メッシュを使用してください。孔径1mmのメッシュを12cm×12cmの正方形にカットします。 柱に岩粉を充填し、ミミズを導入したら(セクション7)、柱の上にメッシュを配置します。注:このメッシュは、ミミズがカラムから逃げるのを防ぐために、カラムの上に配置する必要があります。ミミズが持ち込まれない場合でも、このメッシュを使用して、すべてのカラムで同じ条件を維持することをお勧めします。 メッシュの周りに輪ゴムを置き、所定の位置に保ちます。 図5:3Dプリンターのコラムを保持するリングのモデル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:コラム下部のメッシュシステムの構築スキーム。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 4. 灌漑システムの構築 柱に水を均等に散布するスプリンクラーを設計および作成します3D プリンターを使用して、 図 7 に示すモデルと相対寸法に従ってスプリンクラーの設計を行います。 TPU 95A材料を使用して、3Dプリンターで18個のスプリンクラーを印刷します。注意: 印刷後、スプリンクラーを少なくとも24時間乾かしてから、PEマイクロホースに挿入して破損しないようにしてください。 灌漑システムを設置します:バルブとチューブ。2つのソレノイドバルブの前面にある2つのノーズピースをねじ込み、ソレノイドバルブの背面にある2つのTピースプラグインフィッティングをねじ込みます。注意: ウォーターホースをこのシステムで終了し、他のシステムに継続しない場合は、冷蔵庫の端に向かって配置されるバルブの背面に、Tピースプラグインフィッティングの代わりに2つの接続を備えたプラグインフィッティングをねじ込みます。このようにして、水の接続はここで終わります。 上部のステンレス鋼板の片側に2つのソレノイドバルブを取り付けます。注:1つのバルブが1本の灌漑チューブを制御し、合計18本のカラムのうち8本または10本のカラムを灌漑します。 低密度ポリエチレン(LDPE)灌漑パイプを53cmの2本のチューブに切断します。 各チューブの片側をエンドキャップで閉じます。 チューブのもう一方の端をポリテトラフルオロエチレン(PFTE)テープで包み、ソレノイドバルブに接続します。 最初の灌漑チューブに8つの穴を冷蔵庫の前面に近づけ、2番目の灌漑チューブに冷蔵庫の前面から遠くに10個の穴を開けます。注:圧力調整器の正しい位置と機能に必要であるため、ハンドパンチを使用して穴を開けることは非常に重要です。他のツールをドリルとして使用することはお勧めしません。 圧力調整器を2本のチューブの穴に挿入します。 ポリエチレン(PE)マイクロホースを長さ20cmの18本の小さなチューブに切断して、灌漑パイプからカラムに到達し、圧力調整器に取り付けます。 小さなチューブをアクリル板1の穴に挿入します。 スプリンクラーを柱の表面に対して水平に小さなチューブに挿入します。注意: 灌漑システムの問題(水流の閉塞や制御不能な水流など)が発生した場合、これは次の原因である可能性があります:(a)バルブの誤動作、(b)チューブ内に残っている粒子。(c)PFTEテープがチューブの端に適切に巻き付けられていない。ポイントaについては、バルブを交換します。ポイントbとcについては、カラムの散水を開始する前にチューブを洗浄し、PFTEテープの残留物がそれぞれチューブからぶら下がっていないことを確認してください。バルブの正常な機能を妨げる可能性のある粒子の移動を避けることが重要です。 水の輸送のための接続を設定します。ポリウレタン(PU)ホースを3つの異なるホースに切断して、水接続を行います。ホースの正確な長さは、システムとチャンバーの設計によって異なります。最初のホースを使用して最初のバルブのTピースをタップに接続し、2番目のホースを使用して各バルブのTピースを接続し、3番目のホースを使用して2番目のバルブのTピースを次のシステムに接続します。メモ: 次のシステムに接続する必要がない場合は、3 本目のホースを切断する必要はありません。 PUホースをソレノイドバルブの背面にあるTピースプラグインフィッティングに接続します。 アダプターリングに2つの接続部を持つプラグインフィッティングをねじ込んで、最初のバルブのPUホースをタップに接続します。 蛇口を開けて、水がチューブに流れ込むようにします。 制御システムを設置し、灌漑システムへの接続を設定します。Web 対応コントローラ、8 リレー拡張モジュール、およびレール電源を接続します。メーカーの指示に従って、ポリカーボネートの筐体に入れます。メモ: 1 つのモジュラー コントローラが 1 つのデバイスに対応し、8 つのリレーを制御します。1つのリレーが、特定のバルブの開閉を制御します。 電気ケーブルを使用して2つのバルブを相互に接続し、電源ケーブルを各バルブに接続します。 電源ケーブルのもう一方の端を Web 対応コントローラに接続します。 すべてを電気プラグに接続し、Web対応コントローラーのインターネット接続を確立します。 灌漑設定のオンライン制御を設定して、灌漑速度を設定します。製造元が提供する指示に従って、構成とセットアップを行います。プログラミングとテストには、Web ブラウザーを使用します。 http://10.73.10.250/setup.html に移動します。 ユーザー名とパスワードを使用してログインします。 左側のメニューで、[制御/ ロジック ]、[ タスク]/[関数]の順に移動します。 1つのリレーが1つのバルブの開閉を制御します。各リレーには 2 つのタスクがあり、1 つはリレーをオン (バルブが開く) にし、もう 1 つはリレーをオフにする (バルブが閉じます)。各タスクの設定を変更するには、[ 編集]をクリックします。リレーのタスクをオンにする場合は、[ 開始日 ] と [開始時刻] をクリックして、リレーが動作を開始する日時を設定します (例: 2022年 5 月 4 日 7:45:00、 図 8 を参照)。水やりの頻度を設定するには、[ Set Repeat ] と [Repeat Every] をクリックします (たとえば、1 日1回の散水頻度の場合は、毎日 1 日ごと、 図 8 を参照)。リレーが動作を停止する日付を設定するには、[ 繰り返しの終了日] をクリックします (例: 2022年 5 月 20 日 23:59:59、 図 8 を参照)。 リレーのタスクを開始する場合は、リレーが動作を停止する時刻を設定します。これは、必要な灌漑速度と散水頻度によって異なります(たとえば、毎日繰り返す場合は時間を7:46:30に設定します)。これは、リレーが1日1回の散水頻度で50mL・day-1 の水量で1分30秒間作動することを意味します( 表1を参照)。開始日と終了日は、リレーをオンにするタスク、および散水頻度と同じです。 各リレーの設定が完了したら、必ず「 変更を保存」をクリックしてください。メモ: システムの過負荷を防ぐために、すべてのリレーが同時に動作している必要はありません。異なるリレーのタスクの間には、常に少なくとも30秒の間隔を空けてください(たとえば、デバイス1のリレー1は07:46:30にタスクを終了し、デバイス1のリレー2は07:47:00にタスクを開始します)。 各リレーの設定の開始日と終了日が同じであることを確認します。表1は、異なる散水頻度で異なる水灌漑速度に必要な時間の例を示しています。注意: 灌漑システムでは、リストされているもの以外にも、より多くの水灌漑速度と散水頻度が可能ですが、さまざまな量の水に対してバルブを開いたままにしておく必要がある時間をテストする必要があります。 表1にリストされている灌漑速度については、水圧とシステムの設計に応じて変化する可能性があるため、これが有効かどうかを最初のテストで確認することをお勧めします。 図7:灌漑システム用スプリンクラーの相対寸法のモデル 。 (A)スプリンクラーの上面図。(B)スプリンクラーの側面図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図8:リレーをONにするための灌漑システムの設定表示の例。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 灌水速度(mL・day-1) 水やり回数(回数・日-1) リレーが機能する時間     50 1 95 2 50 5 23     100 1 190 2 100 5 45     150 1 280 2 140 5 55 表1:異なる散水頻度で異なる灌漑速度を可能にするためにバルブを開くのに必要な時間の目安。 5. 岩石粉、有機物、土壌生物相の選定 注:この実験では、岩石粉末、有機物、および土壌生物は、入手可能性、局所的な産出量、および文献レビューに基づいて選択されます。さらに、微生物は、生物剤の技術規則(TRBA)の分類によって決定される非病原性に基づいて選択されます26,27,28。正確なリサーチクエスチョンに応じて、これらの要因が調整される場合があります。 実験用の岩石粉末を選択します。注:これらの実験のために選択された岩石粉末は、デュナイトやダイアベースなどのさまざまな鉱物学的組成の超苦鉄質岩と苦鉄質岩の両方です。各岩石には、細かい(マイクロメートルの範囲)と粗い(ミリメートルの範囲)の2つの主要なクラスの粒度があります。 実験用の有機材料を選択します。注:土壌生物相の食料源としてこれらの実験に選択された有機物は、麦わらであり、肥料や動物飼料の残渣から消化されます。 実験するバクテリアを選択します。注:これらの実験のために選択された細菌は、 枯草菌 と Cupriavidus metalliduransです。バクテリアはライプニッツ研究所DSMZ(ドイツ)から供給されています。バクトペプトン(10 g·L-1)、肉エキス(3g・肉エキス)L-1)、塩化ナトリウム(10g・10g・塩化ナトリウム)L-1)を超純水(18.2mΩ)に溶解し、サプライヤーの指示に従ってください。 古い培養液を接種する前に、すべての培地を121°Cで20分間オートクレーブします(容量=新しい培養液の1%)。 血球計算盤による細胞カウントで細胞密度を決定し、フローサイトメトリーで細胞カウントを確認します。注:この研究では、バイオレットレーザー(405 nm)と青色レーザー(488 nm)を装備し、流速10 μL/minのフローサイトメーターを使用し、FL1チャンネル(EX 488、EM 525/40)で検出しました。 実験する菌類を選択します。注:これらの実験のために選択された菌類は、Knufia petricola、Suillus variegatus、および Aerobasidium pullulansです。 菌類はライプニッツ研究所DSMZ(ドイツ)から供給されていますが、 K.ペトリコラはウェステルダイク研究所(オランダ)から供給されています。麦芽エキス(20g・麦芽エキス)からなる麦芽エキスブロスで菌類培養物を増殖させる。L-1)、D-(+)-グルコース(20 g·L-1)、カゼイン加水分解物(3 g·L-1)を超純水(18.2mΩ)に溶解し、サプライヤーの指示に従ってください。 古い培養液を接種する前に、すべての培地を121°Cで20分間オートクレーブします(容量=新しい培養液の1%)。血球計算盤による細胞カウントにより細胞密度を測定します。 実験するミミズを選択します。注:これらの実験に選ばれたミミズは、内生生物 Aporrectodea caliginosa と Allolobophora chloroticaです。 ミミズは、実験前にオランダのワーヘニンゲン大学&研究所(北緯51度58分51.8秒、東経5度39分38.0秒)近くのDe Blauwe Bergen公園から採取された。 6. 列を埋める 岩石粉末と有機材料の保水能力(WHC)は、最初に各材料を105°Cで乾燥させることにより決定します。 次に、乾燥した材料をボウルに入れ、重量を記録します。材料が十分に濡れるまで少しずつ水を加え、最終的な重量を記録します。WHCは 式1で与えられます。 (1) 6mmのグラインダーでストローを挽きます。 ミネラルと有機物を40°Cで2日間連続してオーブン乾燥します。 ボウルに400gのミネラルと10gの有機物を入れます。注:量は実験のニーズに応じて調整できますが、材料混合物はカラム内に収まる必要があります。 ミネラルの種類、ミネラル粒径、および存在する有機源に応じて、WHCを80%に調整します。 金属製のスプーンですべてを注意深く混ぜます。 カラムに混合物を充填します。 充填したカラムを、 図 2 に示すように、クライメートチャンバーのそれぞれの位置に配置します。カラムをすぐに恒温槽に設置できない場合は、15°Cで保存し、水分の損失を防ぎ、初期条件の変化を制限するためにプラスチックシートで覆ってください。注意: 柱を下部に持ち、内容物が失われないように、アクリル板に注意して挿入してください。 図 9 は、列を埋めるために従う必要のある手順を概略的に示しています。 図9:カラムを埋めるためのさまざまなステップの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 7. 土壌生物相の接種 カラムを充填している間(方法1)またはミミズを添加する直前(方法2)の2つの瞬間に細菌と真菌を接種します。メソッド 1所望の接種密度(細菌の場合は1カラムあたり1.5 x 109〜4.8 x 10 10細胞、真菌の場合は1カラムあたり5.5 x 107〜5.5 x10 8細胞の範囲)に応じて、ピペットを使用して処理に従って水を加えた後、異なる微生物種をミネラルと有機物の混合物に接種します。注:添加水は、接種によって添加される量(ミリリットル)が、WHCの80%に達するように添加される水の総量から差し引かれるように、それに応じて調整する必要があります。 金属製のスプーンですべてを注意深く混ぜます。 カラムに混合物を充填します。 連続して使用する材料をエタノールと混合するために使用したボウルとスプーンを拭きます。 柱を上部メッシュで覆います。 メソッド2:所望の接種密度に応じて、ピペットを用いて処理に応じてカラム表面の異なる微生物種を接種します。 柱を上部メッシュで覆います。 希望の密度(カラムあたり4匹、8匹、または10匹のミミズ)に応じて、ミミズをカラムの表面に静かに堆積させることにより、処理に従ってカラムにミミズを導入します。その後、柱を上部メッシュで覆います。注意: 微生物とミミズの両方を、水やりが始まる1日前に接種して、システムに適応できるようにする必要があります。接種密度は、実験の必要性に応じて変更することができます。これは無菌環境ではなく、空気、水、または投入物によって輸送される微生物による汚染の可能性があることに注意してください。換気による細菌汚染を防ぐため、カラム上部に0.2 μmフィルターを追加してください。 8. サンプルの収集と分析 実験期間の終了時にチャンバーからカラムを取り出します。ミミズを集めて数え、生存率を決定し、その活動を評価します。 岩石粉末と有機材料の混合物を均質化し、微生物分析のためにサブサンプルを採取して、目的の微生物の存在と活性をさらに特徴付けます。 カラムの内容物を40°Cで5〜7日間乾燥させ、その後の固体無機炭素(SIC)の固相分析を行います。 ジェリカンを秤量して最終的な浸出水量を決定し、TA、溶存無機炭素(DIC)、pH、EC、イオンなどのさらなる分析のために浸出水サンプルを収集します。 実験のエンドポイントは、土壌生物がこのシステムの風化速度を強化できるかどうかを決定し、考慮された変数の最適な組み合わせを見つけることであり、これにより、最高の炭素隔離ポテンシャルがもたらされます。これは、さまざまな組み合わせに従って分析されたパラメーターの結果を比較することによって決定します。注:サンプリング戦略とさらなる分析は、実験設定と研究ニーズに応じて調整できます。