设计和建造实验装置，通过土壤生物的活动增强矿物风化

下面，考虑到 18 列的系统，描述了用于构建设置不同部分的详细协议。 1. 构建支撑柱子的框架 准备亚克力板来容纳灌溉系统、柱子、漏斗和收集渗滤液的管道。切割三块尺寸为 63 厘米 x 67 厘米的亚克力板（亚克力板 1-3）和一块尺寸为 45 厘米 x 56 厘米的亚克力板（亚克力板 4）。 在每个亚克力板上，按照以下步骤中的说明切 18 个孔。亚克力板 1 – 顶板：切直径 0.7 厘米的孔，稍后插入灌溉系统的管子。 亚克力板 2 – 距顶板第二：切直径 8 厘米的孔以稍后插入柱子（图 2）。 亚克力板 3 – 距底板第二：切直径 1.2 厘米的孔以稍后插入漏斗。 亚克力板 4 – 底板：切出直径 1.2 厘米的孔，稍后插入将渗滤液带到油桶的塑料管。 此外，在亚克力板 1-1 的每个角上切一个直径为 1.1 厘米的孔，在侧面切一个直径为 3 厘米的孔，以插入不锈钢螺钉。 对于每个亚克力板，使用标签打印机打印带有列数 （1-18） 的塑料标签，并将它们粘贴在相应的孔下方。注意： 根据 2 列的编号在 4、18 和 4 亚克力板上粘贴标签有助于在安装过程中将装置的不同部分放置在各自的位置。 使用不锈钢板和螺钉固定亚克力板。以量身定制的不锈钢板为例，这些不锈钢板是按照 图 3 所示的设计制作的，尺寸为 63.6 cm x 67.3 cm x 4 cm，厚度为 1.5 mm。 在每块不锈钢板的每个角和侧面钻直径为 1.1 厘米的孔。 取不锈钢螺丝（长 50 厘米）。 按照从上到下的顺序插入亚克力板 1（灌溉管）、2（柱）和 3（漏斗）在不锈钢螺钉上。每个角使用两个六角螺母和两个垫圈托架，以将亚克力板固定到位。注意： 每块亚克力板之间保持足够的距离，以便以后插入不同的组件。亚克力板 1 与亚克力板 2 保持 ~19.5 厘米的距离，亚克力板 2 与亚克力板 3 的距离为 ~10.5 厘米，亚克力板 3 与亚克力板 4 的距离为 ~16.5 厘米。 使用两个六角螺母和两个垫圈托架将顶部和底部不锈钢板安装在不锈钢螺钉上。 冰箱系统施工完成后，将整个系统放在冰箱顶部。 图 2：放置柱子的亚克力板 2 设计示意图俯视图。编号标签指示需要放置相应列的位置。请点击这里查看此图的较大版本. 图 3：不锈钢板的设计。 （A，B） 顶板。（C，D）底板。请点击这里查看此图的较大版本. 2. 构建渗滤液收集的制冷系统 设置冰箱以放置油桶。从冰箱上取下两个盖子，用亚克力板 4 更换后盖。注意： 安装后，不应移除此亚克力板。要在冰箱内工作，请提起前盖取下前盖。 将冰箱放入气候室并插上电源。 将冰箱温度设置为 4 °C，并在冰箱内放置一个数据记录器。 用前盖关闭冰箱。 监控数据记录器在夜间记录的数据。如果温度偏离所需值，请取下冰箱底部的格子并调节温度。重复此过程，直到达到所需温度。 使用聚氯乙烯 （PVC） 管道将漏斗连接到油桶。切割 18 根具有适当长度的 PVC 管（内径 0.8 厘米），根据各自的数字从不同的漏斗中到达每个油桶。注意： 长度从最短管的最小 38 厘米到最长管的最大 81 厘米不等。 首次使用前用半水冲洗管道;在任何其他情况下，将它们浸泡在 50 L 水中 4 天，其中稀释 30 g 柠檬酸产品以去除碳酸盐沉淀物。之后，再次用半水冲洗管道。注意：即使柠檬酸产品可以安全使用，也要采取适当的保护措施，避免接触眼睛和长时间接触皮肤。注意：如果有超纯水，最好用它代替半水。 让管道风干24小时。 根据各自的编号将管道插入亚克力板 4 中。 安装漏斗，将渗滤液引导到油桶。首次使用前用乙醇擦拭 18 个漏斗;在任何其他情况下，请遵循与 PVC 管相同的程序。注意：乙醇易燃，可刺激眼睛、皮肤和呼吸道、头晕和浅呼吸。乙醇通过摄入、吸入或皮肤吸收有害。 将漏斗插入亚克力板 3 中，并根据其编号将它们连接到相应的管道。 安装油桶以收集渗滤液。取 10 个容量为 10 L 的高密度聚乙烯 （HDPE） 油桶和 8 个容量为 5 L 的 HDPE 油桶。注：5 L 的油桶用于低灌溉率，而 10 L 的油桶用于高灌溉率（见 表 1）。选择HDPE中的油桶，因为这种材料具有化学惰性。 将 50 mL 洗碗机肥皂稀释在 10 L 自来水中。用这种溶液冲洗一次油桶，用自来水冲洗一次，用半水冲洗一次。在任何其他使用之前重复此清洁过程。注意：如果有超纯水，最好用它代替半水。 让油桶风干24小时。 在每个直径为 1.2 厘米的油桶的盖子上钻一个孔，插入塑料管以收集渗滤液。 用相应的盖子关闭油桶。 按照 图 4 所示的方案将油桶放入冰箱中分成两层，同时将管子连接到油桶。 图 4：冰箱内的油桶分为两层堆叠层，底部（左侧）和顶部层（右侧）。 黑色圆圈表示盖子的方向，而蓝色和绿色矩形分别表示 10 L 和 5 L 油桶。 请点击这里查看此图的较大版本. 3. 构建柱子和网格系统 使用PVC柱作为介宇宙来孵化岩粉和土壤生物将 PVC 管切成 18 列，长度为 15 厘米。 如果是首次使用，请按照程序 1 清洁列，在任何其他情况下按照程序 2 清洁列。程序 1：将色谱柱浸泡在半水中48小时。注意：如果有超纯水，最好用它代替半水。 用半水冲洗色谱柱。干燥并用乙醇擦拭色谱柱。 使用标签或直接在试管上用记号笔对色谱柱进行编号。 程序 2：将色谱柱浸泡在水中 1 天。 用刷子擦去任何实验残留物。 干燥并用乙醇擦拭色谱柱。 使用中间环将柱子固定在漏斗上方。使用3D打印机，设计一个戒指（直径8.5厘米，厚度0.5厘米）。确保在底部画另一个适合亚克力板 2 孔的环，以提高柱子的稳定性（图 5）。 使用热塑性聚氨酯 （TPU） 95A 材料，使用 3D 打印机打印 18 个环。 将色谱柱上的环保持在漏斗上方 2-3 厘米的位置。 使用色谱柱底部的网状系统过滤渗滤液并最大限度地减少颗粒损失。将网格（10μm和20μm孔径）切成12cm x 12cm的正方形。 将网片浸泡在超纯水中 2 天。让网眼风干。 在色谱柱的底部，放置第一个20μm的网格。在 20 μm 的网格上放置 1 厘米的塑料珠层。 将第二个 10 μm 的网格放在 20 μm 网格和塑料珠层的顶部。 放置两个扎带以将网状系统固定到位。拧紧扎带并剪掉其边缘。注： 图 6 显示了如何在色谱柱底部组装网格系统。 使用顶部网状物来避免蚯蚓逃跑。将孔径为 1 毫米的网格切割成 12 厘米 x 12 厘米的正方形。 一旦柱子上填满了岩粉，并引入了蚯蚓（第 7 节），将网眼放在柱子的顶部。注意： 此网应放置在柱子的顶部，以防止蚯蚓从柱子中逸出。如果不引入蚯蚓，仍然建议使用此网格来保持所有色谱柱的相同条件。 在网眼周围放一根橡皮筋以将其固定到位。 图 5：用于固定 3D 打印机柱的环模型。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 6：柱子底部网格系统的构造方案。 请点击这里查看此图的较大版本. 4. 建设灌溉系统 设计和制造洒水器，将水均匀地分布在柱子上使用 3D 打印机，按照 图 7 所示的模型和相对尺寸进行喷头设计。 使用 TPU 95A 材料使用 3D 打印机打印 18 个洒水器。注意： 打印后，让洒水器干燥至少 24 小时，然后再将其插入 PE 微型软管，以免损坏它们。 安装灌溉系统：阀门和管道。拧紧两个电磁阀前面的两个鼻片，在电磁阀后面拧两个 T 形插入式接头。注意： 如果希望水管与此系统一起结束而不是继续到其他系统，请拧上将放置在冰箱末端的阀门背面，这是一个带有两个连接的插入式接头，而不是 T 形插入式接头。这样，水连接就到此为止。 将两个电磁阀安装在顶部不锈钢板的一侧。注意： 一个阀门控制一个灌溉管，而灌溉管又灌溉总共 18 个柱子中的 8 或 10 个柱子。 将低密度聚乙烯 （LDPE） 灌溉管切成两根 53 厘米的管子。 用端盖封闭每根管子的一侧。 用聚四氟乙烯 （PFTE） 胶带包裹管子的另一端，并将其连接到电磁阀。 在靠近冰箱前部的第一根灌溉管上打 8 个孔，在离冰箱前部更远的第二个灌溉管上打 10 个孔。注意： 使用手动打孔器打孔非常重要，因为这对于压力调节器的正确定位和功能是必要的。不鼓励使用其他工具作为钻头。 将压力调节器插入两根管子的孔中。 将聚乙烯 （PE） 微型软管切成 18 根长 20 厘米的小管，从灌溉管到达柱子并将它们连接到压力调节器上。 将小管插入亚克力板 1 的孔中。 将洒水器水平插入小管中，使其水平到柱子的表面。注意： 如果灌溉系统出现问题（例如，水流堵塞或水流无法控制），这可能是因为：（a） 阀门故障，（b） 残留在管中的颗粒;（c） PFTE 胶带未正确缠绕在管子末端。对于 a 点，更换阀门。对于 b 点和 c 点，确保在开始浇水柱之前清洁管子，并且没有 PFTE 胶带的残留物分别悬挂在管子上。重要的是要避免任何可能阻止阀门正常工作的颗粒转移。 设置水的运输连接。将聚氨酯 （PU） 软管切成三根不同的软管用于水连接。软管的确切长度取决于系统和腔室的设计。使用第一根软管将第一阀的 T 形件连接到水龙头，第二根软管将每个阀门的 T 形件连接，第三根软管将第二阀的 T 形件连接到下一个系统。注意： 如果不需要连接到下一个系统，则无需切割第三根软管。 将 PU 软管连接到电磁阀背面的 T 形插入式接头。 通过拧紧适配器环上带有两个连接的插入式接头，将第一个阀门的 PU 软管与水龙头连接。 打开水龙头，让水流入管子。 安装控制系统并设置与灌溉系统的连接。连接支持 Web 的控制器、8 继电器扩展模块和轨道电源。按照制造商提供的说明将它们放入聚碳酸酯外壳中。注意： 一个模块化控制器对应一个设备，该设备又控制八个继电器。一个继电器控制一个特定阀门的打开和关闭。 使用电缆将两个阀门相互连接，并将电源线连接到每个阀门。 将电源线的另一端连接到支持 Web 的控制器。 将所有东西连接到电源插头，并为支持 Web 的控制器建立互联网连接。 设置灌溉设置的在线控制以设置灌溉速率。按照制造商提供的说明进行配置和设置。对于编程和测试，请使用 Web 浏览器。 转到 http://10.73.10.250/setup.html。 使用用户名和密码登录。 在左侧菜单中，转到“ 控制/逻辑 ”，然后转到 “任务/功能”。 一个继电器控制一个阀门的打开和关闭。对于每个继电器，有两个任务，一个是打开继电器（阀门打开），另一个是关闭继电器（阀门关闭）。要更改每个任务的设置，请单击 “编辑”。当要设置继电器的任务时，通过单击开始日期和开始时间来设置继电器必须 开始工作的日期 和 时间（例如，2022 年 5 月 4日 7：45：00;见 图 8）。要设置浇水频率，请单击“ 设置重复 ”和 “重复间隔”（例如，每天每 1 天一次，浇水频率为每天一次;见 图 8）。要设置继电器停止工作的日期，请单击 结束重复日期（例如，2022 年 5 月 20日 23：59：59;见 图 8）。 当要启动继电器的任务时，设置继电器必须停止工作的时间。这取决于所需的灌溉速度和浇水频率，例如，将时间设置为每天重复 7：46：30。这意味着继电器工作 1 分 30 秒，浇水频率为 50 mL·day-1 ，浇水频率为每天一次（见 表 1）。开始和结束日期与设置继电器的任务以及浇水频率相同。 完成每个继电器的设置后，请记住单击 “保存更改”。注意： 并非所有继电器都必须同时工作，以防止系统过载。在不同继电器的任务之间始终留出至少 30 秒的时间（例如，设备 1 的继电器 1 在 07：46：30 结束其任务，设备 1 的继电器 2 在 07：47：00 开始其任务）。 检查每个继电器的设置是否具有相同的 开始 日期和 结束日期。 表 1 显示了在不同浇水频率下不同灌水速率所需的时间示例。注意： 除了列出的灌溉率和浇水频率外，灌溉系统还允许更多的灌溉速率和浇水频率，但需要测试阀门需要为不同数量的水保持打开多长时间。对于 表 1 中列出的灌溉率，最好通过第一次测试来检查这是否有效，因为它可能会根据水压和系统设计而变化。 图 7：具有相对尺寸的灌溉系统喷头模型 。 （A） 喷头的顶视图。（B） 洒水器的侧视图。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 8：用于设置继电器的灌溉系统的设置显示示例。 请点击这里查看此图的较大版本. 水灌量（mL·day-1） 浇水频率（次·天-1） 继电器工作时间（秒）     50 1 95 2 50 5 23     100 1 190 2 100 5 45     150 1 280 2 140 5 55 表 1：阀门打开以允许在不同浇水频率下进行不同灌溉所需的时间指示。 5. 选择岩粉、有机材料和土壤生物群 注：在本实验中，根据可用性、当地发生情况和文献综述选择岩粉、有机材料和土壤生物。此外，微生物是根据其非致病性来选择的，由生物制剂技术规则（TRBA）26,27,28的分类决定。根据确切的研究问题，这些因素可能会进行调整。 选择岩粉进行实验。注：为这些实验选择的岩粉既是超基性岩，也是各种矿物成分的镁铁质岩，如沙丘岩和辉绿岩。每块岩石都有两大类晶粒尺寸，细粒（微米级）和粗粒（毫米级）。 选择有机材料进行实验。注：为这些实验选择作为土壤生物群食物来源的有机材料是小麦秸秆和粪便和动物饲料残留物的沼渣。 选择用于实验的细菌。注意：为这些实验选择的细菌是 枯草芽孢杆 菌和 铜霉菌。细菌来源于莱布尼茨研究所DSMZ（德国）。在由细菌蛋白胨（10 g·L-1）、肉提物（3 g·L-1）和氯化钠（10 g·L-1）溶解在超纯水（18.2mΩ）中，按照供应商的说明进行操作。 在接种旧培养物之前，在121°C下高压灭菌所有培养基20分钟（体积= 新培养物的1%）。 用血细胞计数器通过细胞计数确定细胞密度，并通过流式细胞术验证细胞计数。注：本研究使用配备紫色 （405 nm） 和蓝色 （488 nm） 激光的流式细胞仪，流速为 10 μL/min，并在 FL1 通道（EX 488、EM 525/40）中检测到。 选择用于实验的真菌。注：为这些实验选择的真菌是 Knufia petricola、Suillus variegatus 和 Aerobasidium pullulans。 真菌来源于莱布尼茨研究所DSMZ（德国），但 克斯特里科拉菌除外，后者来自韦斯特戴克研究所（荷兰）。在麦芽提取物肉汤中培养真菌，由麦芽提取物（20 g·L-1）、D-（+）-葡萄糖（20 g·L-1）和酪蛋白水解物（3 g·L-1）溶于超纯水（18.2mΩ）中，按照供应商的说明进行操作。 在接种旧培养物之前，在121°C下高压灭菌所有培养基20分钟（体积= 新培养物的1%）。通过使用血细胞计数器进行细胞计数来确定细胞密度。 选择蚯蚓进行实验。注：为这些实验选择的蚯蚓是内生物种 Aporrectodea caliginosa 和 Allolobophora chlorotica。 在实验之前，从荷兰瓦赫宁根大学和研究中心附近的De Blauwe Bergen公园（51°58’51.8“N 5°39’38.0”E）收集蚯蚓。 6. 填充列 首先在105°C下干燥每种材料，确定岩粉和有机材料的持水能力（WHC）。 然后，将干燥的材料放入碗中并记录重量。一点一点地加水，直到材料足够湿润，并记录最终重量。然后，WHC 由 公式 1 给出。 (1) 通过 6 毫米研磨机研磨吸管。 将矿物质和有机材料在40°C下烘干连续2天。 在一个碗中称量 400 克矿物质和 10 克有机材料。注意：量可以根据实验需要进行调整，但材料混合物应适合色谱柱内。 根据矿物类型、矿物颗粒大小和存在的有机来源将 WHC 调整到 80%。 用金属勺子小心地混合所有东西。 用混合物填充色谱柱。 如图 2 所示，将填充的色谱柱放置在气候室的相应位置。如果色谱柱不能立即放置在气候室中，请将其储存在15°C，并用塑料布覆盖它们，以防止水分流失并限制初始条件的变化。注意： 将柱子放在底部并小心地插入亚克力板中，以免丢失其内容物。 图 9 示意性地说明了填充列时应遵循的步骤。 图 9：填充色谱柱的不同步骤的示意图。 请点击这里查看此图的较大版本. 7. 土壤生物区系接种 在填充色谱柱（方法1）或加入蚯蚓之前（方法2）的两刻接种细菌和真菌。方法 1根据所需的接种密度（细菌每柱 1.5 x 109 和 4.8 x 10 10 个细胞之间的细胞密度范围，真菌每柱 5.5 x 107 和 5.5 x10 8 个细胞之间的细胞密度范围），一旦使用移液管根据处理加入水，将不同的微生物物种接种到矿物质和有机材料的混合物中。注意：添加的水需要相应地调整，以便从添加的水总量中减去通过接种添加的量（毫升），以达到WHC的80%。 用金属勺子小心地混合所有东西。 用混合物填充色谱柱。 擦拭用于将材料与乙醇混合的碗和勺子，以便连续使用。 用顶部网眼覆盖柱子。 方法2：根据所需的接种密度，使用移液管根据处理在色谱柱表面接种不同的微生物种类。 用顶部网眼覆盖柱子。 根据所需的密度（每根柱子 4、8 或 10 条蚯蚓），根据处理情况将蚯蚓轻轻地沉积在柱子表面，将蚯蚓引入柱子中。然后，用顶部网眼覆盖柱子。注意：微生物和蚯蚓都应在浇水开始前 1 天接种，以使它们适应系统。接种密度可根据实验需要改变。请注意，这不是无菌环境，通过空气、水或输入材料运输的微生物可能会造成污染。为防止通风造成细菌污染，请在色谱柱顶部添加一个 0.2 μm 过滤器。 8. 样品采集和分析 在实验期结束时从腔室中取出色谱柱。收集蚯蚓并计数它们以确定它们的存活率并评估它们的活性。 均质化岩粉和有机材料的混合物，并采集子样品进行微生物分析，以进一步表征目标微生物的存在和活性。 将色谱柱的内容物在40°C下干燥5-7天，用于随后的固体无机碳（SIC）固相分析。 称量油桶以确定最终的渗滤液体积，并收集渗滤液样品进行进一步分析，例如 TA、溶解无机碳 （DIC）、pH、EC 和离子。 实验终点是确定土壤生物是否可以提高该系统的风化速率，并找到所考虑变量的最佳组合，从而实现最高的碳封存潜力。通过根据不同的组合比较分析参数的结果来确定这一点。注：采样策略和进一步分析可以根据实验设置和研究需要进行调整。