JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Succesvolle orthotope levertransplantatie bij muizen met behulp van microcomputertomografie-angiografie

Published: September 22, 2023
doi:
10.3791/65537
, , , , , , , , , ,
1Department of Surgery,Nationwide Children’s Hospital, 2COPPER Laboratory,The Ohio State University, 388th Surgical Operation Operations Squadron,WPAFB, 4Center for Regenerative Medicine,The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 5Division of Vascular Diseases and Surgery,The Ohio State University College of Medicine, 6Interdisciplinary Biophysics Graduate Program,The Ohio State University, 7Division of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy,The Ohio State University College of Pharmacy, 8The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, 9Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery,The Ohio State Wexner Medical Center, 10Division of Transplantation, Department of Surgery,The Ohio State Wexner Medical Center

Summary

In dit protocol bespreken we de implementatie van een model van succesvolle orthotope levertransplantatie (OLT) bij muizen. Daarnaast worden ook adjuvantia besproken om de doorgankelijkheid van het transplantaat verder te analyseren na succesvolle OLT in een muis, met name met behulp van microcomputertomografie (microCT)-scans.

Abstract

Microcomputertomografie (microCT) angiografie is van onschatbare waarde voor onderzoekers. Nieuwe ontwikkelingen in deze technologie hebben het mogelijk gemaakt om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen van microvasculatuur en zijn high-fidelity hulpmiddelen op het gebied van orgaantransplantatie. In dit model van orthotope levertransplantatie (OLT) bij muizen biedt microCT de mogelijkheid om allotransplantaatanastomose in realtime te evalueren en heeft het als bijkomend voordeel dat er geen studiedieren hoeven te worden opgeofferd. De keuze van het contrast, evenals de instellingen voor beeldacquisitie, creëren een high-definition beeld, dat onderzoekers onschatbare informatie geeft. Dit maakt het mogelijk om de technische aspecten van de procedure te evalueren en mogelijk verschillende therapieën over een langere periode te evalueren. In dit protocol beschrijven we een OLT-model bij muizen stapsgewijs en beschrijven we uiteindelijk een microCT-protocol dat beelden van hoge kwaliteit kan geven, die onderzoekers helpen bij een diepgaande analyse van solide orgaantransplantatie. We bieden een stapsgewijze handleiding voor levertransplantatie bij een muis en bespreken kort een protocol voor het evalueren van de doorgankelijkheid van het transplantaat door middel van microCT-angiografie.

Introduction

Transplantatie is de enige effectieve therapie voor leverziekte in het eindstadium. Het voordeel van levertransplantatie is ontegenzeggelijk uitstekend, met een mediane overleving van 11,6 jaar versus 3,1 jaar op de wachtlijst1. Er zijn echter aanzienlijke beperkingen, die de brede toepassing van levertransplantatie beperken, en die vooral een gebrek aan geschikte, hoogwaardige donororganen omvatten. Het uitbreiden van de pool van donororganen vereist dus innovatieve strategieën die het gebruik van allotransplantaten mogelijk maken die momenteel als ongeschikt worden beschouwd, waardoor de veiligheidsmarge voor transplantatie wordt vergroot. Om de toegang tot levertransplantatie te verbeteren, is het daarom absoluut noodzakelijk om preklinische studies bij kleine dieren uit te voeren.

Bijzonder belangrijk voor transplantatieonderzoek zijn in vivo modellen van transplantatie. Orthotope levertransplantatie (OLT) bij muizen bestaat al bijna 30jaar 2 en is van vitaal belang voor het bestuderen van vele aspecten van transplantatie, waaronder de karakterisering van immuunresponsen, ischemie-reperfusieschade, acute afstoting, therapeutische effecten van nieuwe middelen en overleving op lange termijn 3,4,5,6,7. Het gebruik van muizen om transplantatie te bestuderen is van vitaal belang omdat het het gebruik van transgene muislijnen mogelijk maakt om de impact van specifieke moleculaire routes op de resultaten van transplantatie te bestuderen. Vastgestelde protocollen voor levertransplantatie bij muizen zijn eerder goed beschreven 8,9.

Er bestaan meerdere methoden voor anastomosen voor de supra- en infrahepatische inferieure vena cava (IVC), poortader (PV) en gemeenschappelijke galwegen (CBD). Ze vertrouwen meestal op handanastomose of een aangepaste vasculaire manchettechniek vergelijkbaar met longtransplantatie bij muizen 10,11,12. Een belangrijke stap in de langetermijnstudie en overleving van de ontvangende muizen, evenals de ontwikkeling van een duurzaam levertransplantatieprogramma bij muizen, is het vermogen om deze kritieke anastomosen te evalueren. Beeldvormingsmodaliteiten om de doorgankelijkheid van levertransplantaten te evalueren, zijn vaak afhankelijk van echografie en computertomografie (CT) in de klinische setting13,14. CT heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van echografie, omdat het zicht kan bieden op de hele buik om elke anastomose te omvatten, hoewel het verkrijgen van deze beelden met echografie bijzonder moeilijk kan zijn bij kleine dieren. Er is veel onderzoek en middelen besteed aan het ontwikkelen van nauwkeurige microCT met als doel dierstudies en de informatie die we kunnen verzamelen uit deze modellen van letsel en ziekte te verbeteren15,16. Hier beschrijven we een protocol voor orthotope levertransplantatie bij muizen (Figuur 1) en beschrijven we kort een protocol voor microCT om de doorgankelijkheid van het transplantaat en de duurzaamheid van anastomosen te evalueren.

Protocol

Mannelijke C57BL/6J-muizen (30 g lichaamsgewicht) werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden in de Nationwide Children’s Hospital Animal Facility. Alle procedures werden humaan uitgevoerd volgens de NIH en de National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals en met goedkeuring van de Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protocol AR17-00045). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. 1. Eerste installatie voor transplantatiechirurgie Stel chirurgische apparaten in.Stel chirurgische bewakingsapparatuur in (d.w.z. hartslagbewakingsapparaat, pulse-ox, modulair monitorsysteem) en anesthesieapparaten. Zet de chirurgische warmhoudplaat, indien beschikbaar, aan op 42 °C. Zorg ervoor dat de beademings- en anesthesieapparaten zijn ingeschakeld om de isofluraanverdamper op te warmen. Vul het anesthesiereservoir met 30 ml vloeibare isofluraan en zorg ervoor dat het beademingsapparaat is aangesloten op de zuurstof.OPMERKING: In dit protocol intuberen we het dier niet; Gebruik alleen een neuskegel voor zuurstofvoorziening. Noteer het lichaamsgewicht van de ontvangende en donormuizen. Schakel de krachtige chirurgische microscoop in en pas de hoogte en focus aan de voorkeuren van de chirurg aan. Zorg ervoor dat de overige chirurgische apparaten zijn ingeschakeld (d.w.z. elektrocauterisatieapparaat). Bereid chirurgische instrumenten voor en leg ze neer, evenals chirurgische banden van 10-0 nylon (Figuur 2).OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten werden gedurende 30 minuten geautoclaveerd bij 121 °C. Bovendien kunnen verschillende configuraties van chirurgische instrumenten even effectief zijn. Bereid de manchetten voor op de poortader (PV) en gemeenschappelijke galwegen (CBD) stents (Figuur 3). Plaats de angiokatheter, evenals de PE10, op een steriel oppervlak onder de krachtige microscoop. Snijd met een #11 chirurgisch mes de angiokatheter door tot een 1,5 mm lange manchet met een lipje van ongeveer 0,75 mm aan de bovenkant van de manchet; snijd de polyethyleen slang (PE10) op een lengte van 2,5 mm. Bewaar de manchetten en stent in steriele zoutoplossing tot ze klaar zijn voor gebruik.OPMERKING: Dit transplantatiemodel maakt gebruik van een angiokatheter van 20 G om manchetten te maken voor PV-reconstructie, evenals een polyethyleen slang 10 (PE10) voor de reconstructie van de CBD. Alle andere anastomosen zijn met de hand genaaid. Bereid oplossingen voor. Bereid een heparine-injectie voor die wordt toegediend bij 100 E in 0,5 ml histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK)-oplossing. Bewaar zoutoplossing, heparine-zoutoplossing, PBS en HTK-conserveringsoplossing op ijs. 2. Aanschaf van donormuizen Induceer anesthesie bij de donormuis door deze in een isofluraan-inhalatiekamer te plaatsen. Zorg ervoor dat de isofluraanconcentratie ongeveer 2,5% is met een zuurstofstroom van 2 ml/min. Wacht 5 minuten totdat een chirurgisch anesthesievlak zich heeft ontwikkeld. Om het juiste niveau van anesthesie te garanderen, knijpt u in de teen van de muis om een reactie uit te lokken; Een gebrek aan reactie geeft aan dat aan het juiste niveau van anesthesie is voldaan. Scheer de buik van de muis met behulp van een elektronische tondeuse en plaats de muis in rugligging op het warmhoudbord. Reinig de buik met povidon-jodium en vervolgens met 70% ethanol. Breng oogzalf onder de ogen van muizen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis onder de krachtige microscoop en houd de muis onder narcose met behulp van een isofluraaninhalatie met een concentratie van 2% met een zuurstofstroom van 2 ml/min. Voer een laparotomie op de middellijn uit met een schaar (voorkeur van de chirurg) van het xiphoid-proces tot de symfyse van de schaamstreek. Voer vervolgens een extra dwarse incisie uit om een ‘kruisachtig’ patroon te creëren dat inferieur is aan de ribben. Gebruik een hemostatische pincet van muggen om het xiphoid-proces in te trekken om voldoende blootstelling van de buikinhoud te bereiken.NOTITIE: De pincet kan worden vastgezet, afhankelijk van de voorkeur van de chirurg. Verwijder de ingewanden en plaats ze aan de linkerkant van de buikholte in een natte gaasspons. Mobiliseer de lever door alle ligamenteuze aanhechtingen te verwijderen. Leg de juiste leverslagader (pHA) bloot. Skeletteer het vat met behulp van een gebogen pincet en maak het vast met 10-0 nylon hechtdraad. Ontleed de gehele lengte van de CBD met behulp van een combinatie van scherpe en stompe dissectie. Voer een ductotomie uit (groot genoeg voor de CBD-stent) zo dicht mogelijk bij de bovenste rand van de alvleesklier om een voldoende lengte te geven voor toekomstig gebruik (~1 cm vanaf de onderste rand van de lever). Breng de galwegstent met een fijne pincet in de CBD en zet deze vast met een 10-0 nylon hechtdraad. Maak het distale aspect van CBD vast met een 10-0 nylon hechting (Figuur 4). Trek de rechter leverkwab terug in de richting van de xiphoid met behulp van een natte gaasspons en leg de IVC bloot. Mobiliseer de infrahepatische IVC (IHIVC) weg van het retroperitoneum en schroei de rechter bijnierader dicht met behulp van een draagbaar cauterisatieapparaat (zie Materiaaltabel). Ontleed de rechter nierslagader en -ader en ligate met respectievelijk 7-0 en 10-0 nylon. Snijd de rechter nierader en slagader en resterende ligamenteuze aanhechtingen door. Verwijder ten slotte de rechternier.OPMERKING: Dit wordt gedaan om een betere belichting te hebben bij het uiteindelijk snijden van de IHIVC. Injecteer de 0,5 ml koude HTK met 100 U heparine-oplossing door de PV met een naald van 30 G. Wacht 1 minuut totdat de heparine systematisch is verdeeld. Snijd de poortader net boven de miltina en de superieure-mesenteriale ader door. Injecteer langzaam koude HTK-conserveringsoplossing met heparine in de IHIVC met een naald van 30 G om de donorlever te doordringen. Stop met het injecteren van de oplossing zodra de vloeistof die uit de PV komt helder is. Nadat de injectie is voltooid, plaatst u een microklem op IHIVC net boven de rechter nierader en snijdt u net onder de klem door. Zodra deze stap is voltooid, schakelt u de ventilator uit en stopt u met isofluraan, aangezien het dier net is geëuthanaseerd. Snijd de CBD distaal door naar de stent die eerder in stap 2.7 is geplaatst. Identificeer bovendien het cystische kanaal en maak het kanaal vloeibaar met een 10-0 nylon hechtdraad. Pak vervolgens de koepel van de galblaas vast met een pincet en ontleed los van de galblaasfossa met behulp van een combinatie van scherpe en stompe dissectie. Zodra de galblaas voldoende is gemobiliseerd, voltooit u met behulp van een veerschaar de cholecystectomie door het cystische kanaal boven de eerder geplaatste hechting door te knippen. Trek de lever inferieur terug om de suprahepatische IVC (SHIVC) bloot te leggen. Snijd de SHIVC door en let er vooral op dat de anastomose bij het ontvangende dier voldoende lang is. Ontleed extra ligamenteuze aanhechtingen aan de lever en lever de donorlever ex-vivo af en plaats het orgaan in een container met koude zoutoplossing. 3. Voorbereiding van de levertransplantaat op de achtertafel Doe ijs in een geïsoleerde container en plaats een petrischaal op het bedje van ijs. Vul de petrischaal met koude zoutoplossing. Plaats het levertransplantaat in de schaal zodat het viscerale oppervlak bloot komt te liggen. Plaats de PV door de eerder geselecteerde manchet en verlaat de ader zodat het binnenste endotheeloppervlak bloot komt te liggen. Zet de manchet vast met 10-0 nylon hechtdraad. Zorg ervoor dat de hechting in de groeven van de manchet ligt voor het beste resultaat (Figuur 5). Pas het levertransplantaat aan om de SHIVC bloot te leggen en plaats twee 8-0 nylon hechtingen op respectievelijk 3′ en 9 uur oriëntatie voor eventuele anastomose bij het ontvangende dier. Pas het levertransplantaat opnieuw aan om de IHIVC bloot te leggen en plaats twee 8-0 nylon hechtingen op respectievelijk 3′ en 9 uur oriëntatie voor eventuele anastomose bij het ontvangende dier. 4. Werking van de ontvanger OPMERKING: Aangezien dit een steriele operatie is, dient u handschoenen en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken en antibiotica toe te dienen. 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan toedienen als preoperatieve analgesie op het moment van de operatie. Leg de pHA bloot zoals bij de donoroperatie; Gebruik alleen een laparotomie op de middellijn in plaats van de eerder beschreven incisie in de buik. Mobiliseer de lever en snijd alle ligamenteuze aanhechtingen door. Bind bovendien de linker middenrif- en parao-oesofageale vaten vast met 10-0 nylon hechtdraad. Trek de lever inferieur terug en ontleed de SHIVC uit het retroperitoneum. Trek vervolgens de lever superieur terug en ontleed de IHIVC los van het retroperitoneum. Cauteriseer indien nodig kleine overbruggingsaders en lumbale aders met dezelfde techniek als eerder beschreven. Cauteriseer de rechter bijnierader met cauterisatie in de hand en leg het leverhilum bloot. Maak de pHA vast met 10-0 nylon hechtdraad. Ontleed vervolgens de CBD vrij van de PV en ligate de CBD met 7-0 hechting dicht bij de vertakking van de CBD om een voldoende lengte te geven voor de CBD-anastomose. Gebruik een microklem om infrahepatische IVC vast te klemmen en de PV tijdelijk vast te zetten met een 7-0 hechtdraad. Start de an-hepatische fase. Stop het inademen van isofluraan.OPMERKING: Na het afklemmen van de poortader en IVC wordt de leverveneuze terugkeer volledig geblokkeerd in de anhepatische fase. Het geïnhaleerde anestheticum isofluraan wordt gemetaboliseerd door de lever; De inademing ervan wordt dus tijdelijk gestopt, omdat accumulatie kan leiden tot cardiopulmonale collaps. Injecteer 0,5 ml heparine-zoutoplossing via de PV van de lever met een naald van 30 G om het orgaan door te spoelen. Plaats microvasculaire klemmen op de SHIVC en IHIVC zo proximaal en distaal mogelijk om voldoende lengte over te laten voor anastomose. Snijd de oorspronkelijke SHIVC, IHIVC, PV (dicht bij de eerder geplaatste hechtdraad) en eventuele resterende ligamenteuze aanhechtingen aan de oorspronkelijke lever van de ontvanger door en lever de oorspronkelijke lever ex vivo af.NOTITIE: De IHIVC-klem moet zich boven de rechter nierader bevinden. Plaats het donorlevertransplantaat in de buikholte en trek het hilum van het donortransplantaat terug om de PV bloot te leggen. Spoel zowel de donor als de oorspronkelijke PV met 0,5 ml heparine-zoutoplossing met behulp van een naald van 30 G om de bloedvaten te ontluchten om luchtembolie te voorkomen. Steek vervolgens de eerder gemaakte manchet van donor-PV in het lumen van de ontvangende lever-PV en plaats indien nodig hechtingen om te helpen bij de anastomose (8-0 hechting). Zet de anastomose vast met een 7-0 hechting (Figuur 6). Draai het bord 180°. Voer een met de hand genaaide anastomose uit met 10-0 nylon hechting met de donor en native SHIVC. Na voltooiing van de anastomose van de achterwand, spoel met 0,5 ml heparinezoutoplossing om de lucht te ontluchten om luchtembolie te voorkomen. Volledige anastomose van de bovenwand (figuur 7). Verwijder eerst de ligatiehechting van PV; verwijder vervolgens de vasculaire klemmen van SHIVC om met reperfusie te beginnen. Beëindig de leverfase en hervat de inhalatie van isofluraan. Voer met de hand genaaide anastomose uit met 10-0 nylon hechtdraad, op dezelfde manier als voor de SHIVC-anastomose, om IHIVC te reconstrueren. Verwijder na voltooiing van de reconstructie de microklem van de inheemse en donor-IHIVC om te renderfuseren (Figuur 8). Voer de CBD-anastomose uit door een ductotomie te maken op de ontvangende CBD in de buurt van de eerder geplaatste hechting. Plaats de stent in de donor-CBD in het CBD-lumen van de ontvanger en zet de anastomose vast met 10-0 hechting (Figuur 9). Spoel de buikholte met 1 ml zoutoplossing; Controleer de hemostase en schroei eventuele resterende bloedende bloedvaten dicht. Sluit de incisie in de buik in twee lagen met behulp van een 6-0 hechting. Plaats het dier in een warme broedmachine (42 °C) om te herstellen en laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer bij bewustzijn is gekomen en voldoende actief is. Dien 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan toe na de operatie en ga door met de toediening om de 8 tot 12 uur gedurende 48 uur na de operatie. Dien bovendien carprofen (0,2 ml opgelost in 400 ml water) toe via de waterfles van het ontvangende dier gedurende maximaal 7 dagen na de operatie. Observeer het ontvangende dier gedurende 4-5 uur en zodra het volledig is hersteld, brengt u het terug naar de huisvestingslocatie, aangezien het nu veilig is om bij andere dieren te zijn.OPMERKING: Pijnstillers en antibiotica kunnen worden toegediend volgens de aanbevelingen van de lokale commissie voor dierethiek. 5. Muis microCT angiografie beeldvorming Nadat u de muis gedurende het vooraf bepaalde onderzoeksinterval hebt geobserveerd, bereidt u de muis voor om de doorgankelijkheid van het allotransplantaat te evalueren met behulp van microCT-angiografie. Zorg ervoor dat de beademings- en anesthesieapparaten zijn ingeschakeld om de isofluraanverdamper op te warmen. Vul het anesthesiereservoir met 30 ml vloeibare isofluraan en zorg ervoor dat het beademingsapparaat is aangesloten op de zuurstof. Schakel de microCT-scanner in en zorg ervoor dat alle software goed werkt. Start de acquisitiesoftware op het microCT-scannersysteem. Klik op de monitor van de microCT-eenheid op Systeem initialiseren en kies de CT-scanmodus. Werp het bed uit; Bevestig het muisbed en vergrendel het. Zet het warmhoudbord aan op 42 °C voor de herstelkooi. Vul een spuit van 1 ml met 100 μL CT-contrastmiddel. Bevestig een naald van 30 gauge voor toekomstige intraveneuze toediening van contrast. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten. Plaats een muis in het staartaderfixatiesysteem. Zodra de muis volledig in het fixatiesysteem zit, sluit u de poort van het systeem, laat u de staart verticaal vallen en veegt u deze voorzichtig af met een alcoholoplossing (70% ethanol).OPMERKING: Het succes bij het canuleren van de staartader kan worden vergroot door de staart van het dier op te warmen door deze enkele minuten in een gehandschoende hand te houden. Pak de staart vast in de richting van het distale aspect en plaats twee vingers (wijsvinger en middel) rond de staart proximaal van de geplande injectieplaats. Plaats het distale aspect van de staart (onder de injectieplaats) tussen duim en ringvinger. Oefen met beide sets vingers lichtjes druk uit en steek de naald op een ondiepe diepte in de ader, waarbij u ervoor zorgt dat de spuit en de naald evenwijdig aan de staart zijn. Terwijl u de druk van de wijsvinger op de proximale staart loslaat, dient u het CT-contrastmiddel intraveneus toe. Vermijd aspiratie met de spuit, omdat dit ertoe kan leiden dat de ader instort.OPMERKING: Er mag geen weerstand worden gevoeld tijdens de injectie als de naald op de juiste manier in de ader is geplaatst. Als er weerstand is, verwijder dan de naald en plaats deze opnieuw boven de oorspronkelijke injectieplaats. Als de canulatie van de ader zelfs na twee pogingen mislukt, vervang dan de naald. Nadat u het contrast met succes hebt geïnjecteerd en de naald hebt verwijderd, drukt u zachtjes op de injectieplaats met behulp van een steriel gaasje om het bloeden te stoppen. Breng de muis over naar de isofluraan-inhalatiekamer en stel de concentratie in op 2.5% met een zuurstofstroom van 2 ml/min en wacht 3-4 minuten. Zodra een anesthesievlak tot stand is gebracht, brengt u de muis snel over naar het microCT-scannerbed en legt u deze in buikligging op de scannertafel (Figuur 10). Bedek de ogen van het dier met de juiste hoeveelheid oogzalf. Plaats de neuskegel op de juiste manier over het dier en zorg ervoor dat lucht en isofluraan goed door de neuskegel stromen. Gebruik dezelfde anesthesieparameters die eerder zijn beschreven (stap 5.12). Smeer en plaats een rectale temperatuursonde om de lichaamstemperatuur van het dier continu te controleren tijdens de beeldvorming. Plaats een gasmasker in contact met de muis. Gebruik tape om een ECG-pad aan de linker-, rechtervoor- en linkerachterpoten te bevestigen. Gebruik ultrasone gel om het signaal tussen het ECG-kussen en de huid te verbeteren. Controleer het ECG en het ademhalingssignaal op de computersoftware om er zeker van te zijn dat de juiste QRS-complexen op de monitor te zien zijn. Om dit te doen, vinkt u Logische afleiding aan op het tabblad Broninstellingen en kiest u de afleiding met de duidelijkste ECG-curve.NOTITIE: De logische draden komen overeen met de drie ECG-pads die zijn verbonden met de rechter-, linkerborst- en onderbeen. Elke afleiding vertegenwoordigt een ECG-curve. Stel Gain in voor de juiste signaalhoogte, meestal is 4 of 8 goed. Selecteer dual gating. Pas op het tabblad Beeldscherminstellingen de weergave-instellingen aan voor een duidelijke signaalweergave: vink de vakjes naast ECG en RESP aan en stel ze elk in op 500. Controleer op het tabblad Trigger Set Up of Channel A, Channel B en DualTrig zijn aangevinkt. Zorg ervoor dat ook de volgende parameters zijn ingesteld: Drempel: wanneer het signaal onder deze waarde zakt; stel de waarde in op 2.500; Hysterese: zorg ervoor dat het signaal de hysterese kruist om een software-triggerpoint te creëren waarop een nieuwe activeringscyclus begint; stel de waarde in op 300; Vertraging: wacht voordat de trigger wordt verzonden; stel de waarde in op 100; Remmen: er kan gedurende deze periode geen signaal worden gegenereerd, zet de waarde op 200. Zorg ervoor dat de drempel voor ECG onder de hysteresewaarde en boven de piek van het sT-segment op het scherm ligt. Plaats het dier in de scanner en druk op Afbeelding bijwerken. Maak een röntgenverkenningsbeeld van het dier om het juiste gezichtsveld en de juiste anatomische scandekking te selecteren voor het volgende microCT-beeld. Voer microCT-angiografiebeeldacquisitie uit met behulp van de volgende parameters: Vergrotingen: Ultrafocus, Scanhoek: Volledige (360) scan, Energie: Enkelvoudig, Scanmodus: Gated, Instelling: Standaard (volledige 360° rotatie, röntgenbuis standaardinstellingen van 0.33 mA en 55 kV, 0.750° graden per stap, 1 projectie per stap, 1 x 1 binning en 40 ms belichtingstijd; dual gating betekent cardiale en respiratoire gating) (Figuur 11). Breng het dier na voltooiing van de scan over naar een voorverwarmde herstelkooi. Zodra het dier volledig hersteld is, brengt u het terug naar zijn primaire kooi. Reconstrueer microCT-beelden met behulp van systeemsoftware. Stel na het uploaden van de afbeelding de blauwe balken zo in dat deze zich uitstrekt over het anatomische interessegebied; Bekijk een voorbeeld van een segment om het volume kleiner te maken en zo beperkt mogelijk tot de muis (deze fase helpt om de grootte van de gereconstrueerde afbeelding te verkleinen). Schakel het volume van de omtrek van het interessegebied in om de afbeeldingsgrens te optimaliseren. Kies een voxelgrootte van 40 μm, een Hann-projectiefilter en een Gaussiaans volumefilter (80 μm). Ga naar Geavanceerd | Image-based gating en pas de triggervensters en fase aan op respectievelijk 0,5 en 0,6, kies 10 fasen voor cardiale gating en druk vervolgens op de volumereconstructieknop .

Representative Results

Voor die onderzoekers die geen chirurg zijn, niet bekend zijn met anatomie of zich niet op hun gemak voelen bij het interpreteren van radiologische resultaten, moet een goede beeldanalyse worden uitgevoerd door personeel met de juiste opleiding. Het succes van een OLT in een muis wordt aangetoond in bovenstaand protocol. Bovendien, om de onderzoeksstatistieken te verbeteren en real-time feedback te geven voor het succes van een transplantatie, en om de noodzaak van obductie te elimineren, kan een microCT-angiografiescan worden gebruikt om nauwkeurige en duidelijke beelden te leveren. Representatieve afbeeldingen zijn opgenomen in dit manuscript (Figuur 11). Representatieve beelden van in vivo mislukte anastomose zijn te zien in figuur 12. Degenen die bekend zijn met de anatomie en vasculatuur van de lever kunnen open veneuze anastomosen van het IVC zien. In sommige omstandigheden kan ook de poortader worden gevisualiseerd, wat in dit model gemakkelijk te maken is dankzij de poortadermanchet. Het bekijken van open anastomosen geeft het technische succes van de operatie aan. Bovendien kan 3D-reconstructie van deze beelden aanvullende informatie opleveren voor onderzoekers en een gedetailleerder beeld van de vasculaire anatomie. Met behulp van dit bovenstaande model is de mortaliteit in het OLT-muizencohort ~40-45%. Figuur 1: Overzicht van orthotope levertransplantatie. (A) Grafische tekening met de vier verschillende anastomosen: i) suprahepatische IVC-anastomose, ii) infrahepatische IVC-anastomose, iii) poortaderanastomose, iv) gewone galweganastomose. Elke pijl geeft een relatieve locatie aan voor waar het vat of kanaal moet worden doorgesneden: suprahepatische IVC (protocolstap 2.13), infrahepatische IVC (protocolstap 2.11), poortader (protocolstap 2.10) en gemeenschappelijke galweg (protocolstap 2.7). (B) In-vivodiagram van anastomosen. Schaalbalk = 2 mm. Afkorting: IVC = inferieure vena cava. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Chirurgische instrumenten die bij chirurgie worden gebruikt. (A) 45° fijne pincet, (B-E) fijne pincet, (F) gebogen naaldhouder/pincet, (G) rechte pincet, (H) vasculaire klemapplier, (I) hemostaat, (J) naaldhouder, (K) elektrocauterisatieapparaat, (L) #11 mes, (M) abdominaal oprolmechanisme, (N,O) microschaar, (P) fijne schaar, (Q) chirurgische schaar, (R,S) Yasargil-klemmen, (T) bulldog-aderklem, (U) microvasculaire klem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Manchet van de poortader en stent van de galwegen. Ex vivo beeld van stents en manchetten voor gebruik. Schaalbalk = 3,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Gewone galwegstenting tijdens donoroperatie. (A) Galwegstent die in de galwegen wordt ingebracht. (B) Galwegstent die in de galwegen is bevestigd. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Plaatsen van de poortadermanchet tijdens de voorbereiding van de levertransplantaat op de achtertafel. (A) Poortader door de veneuze manchet halen. (B) Geëverteerde ader over de manchet. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Anastomose van de poortader tijdens de operatie aan de ontvanger. (A) Het inbrengen van de adermanchet in de poortader van de ontvanger. (B) Anastomose van de poortader vastgezet met hechtdraad. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Suprahepatische IVC-anastomose tijdens de operatie van de ontvanger. (A) De achterwand van de anastomose is compleet. (B) Voltooide SHIVC-anastomose. Schaalbalk = 2 mm. Afkortingen: IVC = inferieure vena cava; SHIVC = suprahepatische IVC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Infrahepatische IVC-anastomose tijdens de operatie van de ontvanger. (A) De achterwand van de anastomose is compleet. (B) Voltooide IHIVC-anastomose. Schaalbalk = 2 mm. Afkortingen: IVC = inferieure vena cava; IHIVC = infrahepatische IVC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Gemeenschappelijke galweganastomose tijdens de operatie van de ontvanger. (A) Het plaatsen van een galwegstent in de gemeenschappelijke galwegen van de ontvanger. (B) Het veiligstellen van galweganastomose. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 10: MicroCT-angiografie van muizen bij dieren. (A) Injectie van de staartader van muizen om contrast toe te dienen. (B) Muis wordt door de microCT-machine geleid. Afkorting: microCT = microcomputertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 11: Representatieve beelden van microCT-angiografie van de doorgankelijkheid van het transplantaat. (A,B) Contrast is te zien in de hele IVC, wat de doorgankelijkheid van de suprahepatische en infrahepatische anastomosen aantoont. (C) Contrast in de poortader, wat opnieuw de doorgankelijkheid aantoont. (D) 3D-reconstructie van het vaatstelsel. Afkortingen: microCT = microcomputertomografie; IVC = inferieure vena cava; PV = poortader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 12: Representatieve beelden van mislukte in vivo anastomosen. (A) Mislukte anastomose van de poortader als gevolg van vervorming van de ader resulterend in een gebrek aan bloedstroom. (B) Mislukte suprahepatische IVC-anastomose als gevolg van overmatig bloeden. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

OLT bij knaagdieren is goed beschreven in de literatuur 2,8. Om deze technisch veeleisende procedure uit te voeren, is vaak meerdere jaren microchirurgie (of chirurgie in het algemeen) vereist, omdat dit een robuust begrip van anatomie en technische bekwaamheid vereist. Bij het ontwikkelen van dit model werden we geconfronteerd met verschillende technische problemen die allemaal te maken hadden met de anastomosen. Vooral bij de PV-anastomose is het vaak moeilijk om de ader te stabiliseren voor anastomose. We hebben ontdekt dat het plaatsen van een of twee hechtingen (voorkeur van de chirurg) helpt bij het vergemakkelijken van het plaatsen van manchetten. Opgemerkt moet worden dat het plaatsen van meer hechtingen de operatietijd verlengt.

Bovendien bevindt de SHIVC zich diep in de buikholte en is het moeilijk om een klem op te plaatsen om voldoende blootstelling te geven. We hebben ontdekt dat als de muis zo ontspannen mogelijk is in zijn terughoudendheid, dat zal bijdragen aan de flexibiliteit van de ader. Uiteindelijk is het aan de chirurg om de juiste plaatsing met de praktijk te bepalen. Bovendien is bij de CBD-anastomose het kanaal weer erg delicaat. Het kan moeilijk zijn om hechtingen te plaatsen om het kanaal te stabiliseren, en mogelijk zal het plaatsen op een klein stukje gaas helpen bij de stabilisatie ervan. Ten slotte, aangezien alle kleine zoogdieren uniek delicaat zijn met betrekking tot de anesthesietijd, is het belangrijk om de operatie zo snel mogelijk uit te voeren. Ideale chirurgische tijden zijn als volgt: 1) donoroperatie, 45-60 min; 2) voorbereiding van de achtertafel, 15 min; 3) Bediening van de ontvanger, 60-80 min. Oefening zal helpen bij het verminderen van verspilde beweging.

Naarmate diermodellen vorderen, is ook het vermogen om het succes van studie-interventies te evalueren toegenomen. MicroCT werd eind jaren negentig voor het eerst gebruikt om onderzoek te doen naar vasculatuur bij ratten17. Er zijn veel uitdagingen bij het uitvoeren van nauwkeurige en duidelijke microCT-angiografieonderzoeken bij knaagdieren. De meeste uitdagingen komen echter voort uit de korte hart- en ademhalingscycli van deze zoogdieren. Dit wordt ondervangen door korte belichtingen te gebruiken om bewegingsartefacten te beperken, evenals hogere fotonfluentiesnelheden18. Over het algemeen vonden we dat het gebruik van cardiale gating, evenals de aanpassing van isofluraanconcentraties om de ademhalingsfrequentie te verlagen, de duidelijkste beelden opleverde. We hebben ook ontdekt dat het gebruik van knaagdierspecifieke contrasttiming voor specifieke fasen: leverarteriële fase, portal-veneuze fase en vertraagde fase ook de visualisatie heeft verbeterd19. Het gebruik van ExiTron nano 12000 contrast heeft verschillende voordelen en kan de algehele beeldkwaliteit verbeteren. Het biedt de sterkste contrastverbetering in de lever20 en het bloed21. Een ander voordeel is dat het contrast tot 120 uur na de eerste injectie in de lever aanwezig is, wat de bijbehorende levertoxiciteit zou kunnen verminderen, aangezien er minder contrast nodig is als herhaalde scans nodig zijn20.

Bovendien, omdat scans worden uitgevoerd met de muis verdoofd met isofluraan, verandert de contrastverbetering niet met deze verandering in fysiologie20. Door gebruik te maken van deze beeldvormingstechnieken en ExiTron-contrast is een duidelijke evaluatie van succesvolle anastomosen in OLT mogelijk. MicroCT maakt niet-invasieve evaluatie van in-vivo allotransplantaten over een langere periode mogelijk. Dit protocol vermindert het aantal dieren dat moet worden opgeofferd om vasculaire anastomosen te evalueren en biedt de mogelijkheid om therapieën gedurende enkele weken en hun effect op het vaatstelsel te bestuderen.

Beperkingen
Opgemerkt moet worden dat, hoewel er meerdere revisies van het OLT-model hebben plaatsgevonden om de techniek te perfectioneren, de visualisatie van de anastomosen met behulp van microCT nog steeds een continu proces is. Bovendien biedt muis-OLT een uniek inzicht in de transplantatiegeneeskunde. Het is echter geen allesomvattend model, omdat het moeilijk is om deze muizen langer dan 1 week in leven te houden. Aanvullende transplantatiemodellen moeten ook worden gebruikt om preklinische experimenten verder te onderbouwen.

Conclusies
De vooruitgang op het gebied van microCT is de afgelopen tien jaar snel gevorderd en biedt onderzoekers nieuwe hulpmiddelen van onschatbare waarde op het gebied van diermodellen en transplantatie. In de toekomst zullen meer gedetailleerde 3D-beeldvorming meer inzicht bieden in onderzoek en ontdekking.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SMB wordt ondersteund door de subsidie van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) R01DK1234750. BAW wordt ondersteund door de National Institutes of Health National Heart Lung and Blood Institute-subsidie R01HL143000.

Materials

#11 Blade Fisher Scientific 3120030
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
10-0 nylon suture AD Surgical M-N510R19-B
20 G Angiocath Boundtree 602032D
30 G Needle Med Needles BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets Elanco NA
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer USA Medical and Surgical Supplies BM-DEL1
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 Ambler Surgical USA 18-181
C57BL/6J mice  Jackson Labs
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Store RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science tools 11254-20
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° Fine Science tools 11253-25
ExiTron nano 12000 Miltenyi Biotec 130 - 095 - 698 CT contrast agent 
Forceps Fine Science tools 11027-12
Halsted-Mosquito Hemostat Roboz Surgical RS-7112
heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
histidine-trypotophan-ketoglutarate  University Pharmacy NA
Insulated Container YETI ROADIE 24 HARD COOLER https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Mirco Serrefines Fine Science tools 18055-05
Mouse Rectal Temperature Probe WPI Inc NA
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight Micrins MI1540
PE10 Tubing  Fisher Scientific BD 427400
perfadex XVIVO Perfusion AB REF99450
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra NA
saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science tools 14090-11
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter Pro Lab Corp MH-100
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent scientific SS-MVG-Module
Surgical microscope Leica M500-N w/ OHS
U-CTHR MI Labs NA CT Scanner software
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasagil clamp Aesculap FT351T
Yasagil clamp Aesculap FT261T
Yasagil clamp applicator Aesculap FT484T
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
  2. Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
  3. Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
  4. Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
  5. Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
  6. Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
  7. Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
  8. Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
  9. Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
  10. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
  11. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  12. Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
  13. Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
  14. Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
  15. Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
  16. Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
  17. Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
  18. Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
  19. Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
  20. Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
  21. Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).

Tags

Orthotopic Liver TransplantationMicrocomputed Tomography AngiographyMouse ModelAllograft InjuryVascular AnastomosisThrombosisContrast TimingCardiac GatingIsofluraneLongitudinal EvaluationTransplantation Research

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zeng, Q., Gouchoe, D. A., Nabavinia, M., Lee, Y. G., Wang, X., Shaffer, T. A., Stacy, M. R., Peterson, B. R., Whitson, B. A., Breuer, C., Black, S. M. Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography. J. Vis. Exp. (199), e65537, doi:10.3791/65537 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image