JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65525
, , , , ,
1Associate Laboratory i4HB – Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO – Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia,Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology,Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology,Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark,Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies – Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies – PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology,Universidade NOVA de Lisboa

Summary

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC’s) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC’s te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC’s verbetert.

Abstract

Siaalzuren zijn negatief geladen monosacchariden die meestal worden aangetroffen aan de uiteinden van glycanen op het celoppervlak. Vanwege hun hydrofiliciteit en biofysische kenmerken zijn ze betrokken bij tal van biologische processen, zoals modulatie van de immuunrespons, herkenning van zelf- en niet-zelfantigenen, koolhydraat-eiwitinteracties, enz. De cellulaire inhoud van siaalzuur wordt gereguleerd door sialidase, dat de verwijdering van siaalzuurresiduen katalyseert. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat sialo-glycanen van cruciaal belang zijn bij het bewaken van immuunsurveillance door zich bezig te houden met cis – en transremmende Siglec-receptoren op immuuncellen. Evenzo worden glyco-immuuncontrolepunten bij kanker cruciale doelen voor de ontwikkeling van immunotherapieën. Bovendien worden dendritische cellen (DC’s) gezien als een belangrijk onderdeel van immunotherapieën, vooral in kankeronderzoek, vanwege hun unieke rol als professionele antigeenpresenterende cellen (APC) en hun vermogen om adaptieve immuunresponsen op gang te brengen en immunologisch geheugen te genereren. Niettemin is de functie van DC’s afhankelijk van hun volledige rijping. Onrijpe DC’s hebben een tegengestelde functie ten opzichte van rijpe DC’s en een hoog siaalzuurgehalte, wat hun rijpingsniveau verder tempert. Dit verlaagt het vermogen van onrijpe DC’s om T-cellen te activeren, wat leidt tot een gecompromitteerde immuunrespons. Bijgevolg induceert het verwijderen van siaalzuur van het celoppervlak van menselijke DC’s hun rijping, waardoor de expressie van MHC-moleculen en de antigeenpresentatie toenemen. Bovendien kan het de expressie van co-stimulerende moleculen en IL-12 herstellen, waardoor DC’s een hoger vermogen hebben om T-cellen te polariseren in de richting van een Th1-fenotype en specifiek cytotoxische T-cellen te activeren om tumorcellen te doden. Daarom is siaalzuur naar voren gekomen als een belangrijke modulator van DC’s en wordt het gebruikt als een nieuw doelwit om hun therapeutisch gebruik te bevorderen. Deze studie biedt een unieke benadering voor de behandeling van in vitro monocyt-afgeleide DC’s met sialidase, gericht op het genereren van DC-populaties met verschillende fenotypes van siaalzuur op het celoppervlak en op maat gemaakte rijpings- en co-stimulerende profielen.

Introduction

Siaalzuurdragende glycanen (sialoglycanen) hebben veel belangstelling gekregen vanwege hun immunomodulerende rol. Het monosacharide siaalzuur, dat het meest voorkomt bij mensen in de vorm van N-acetylneuraminezuur, presenteert fundamentele liganden voor lectines met een erkende rol in de immunologie, zoals Selectins en Siglecs. Deze lectines herkennen sialoglycanen op dezelfde cel (cis) of op verschillende cellen (trans) en spelen een belangrijke rol bij interacties tussen gastheer en ziekteverwekker en verschillende fysiologische en pathologische cellulaire activiteiten 1,2,3. Aangezien siaalzuur de eindposities van glycoconjugaten op het celoppervlak inneemt, kan het bovendien de onderliggende structuren verbergen, waardoor het contact tussen cellen wordt geremd via niet-specifieke afstotende effecten of door de detectie door andere lectines te belemmeren4. De activiteit van een verscheidenheid aan sialyltransferasen (die siaalzuren overbrengen) en van sialidasen (die siaalzuurbindingen splitsen) in de cel bepaalt de hoeveelheid siaalzuur die aan het oppervlak aanwezig is. Bovendien kunnen oplosbare sialyltransferasen en sialidasen die door de gastheer of ziekteverwekkers tot expressie worden gebracht, de hoeveelheid siaalzuur op het celoppervlak extrinsiek wijzigen 5,6.

Afwijkende sialylatie is een kenmerk van verschillende pathologische aandoeningen. Bij auto-immuunziekten kan hyposialylering bijdragen aan ongeremde immuunactivatie en orgaanschade, aangezien siaalzuur helpt bij het onderscheiden van zelfantigenen en het reguleren vanontstekingsreacties. Omgekeerd resulteert hypersialylering in de overexpressie van sialoglycanen, zoals sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigenen, polysiaalzuur en gangliosiden, wat een kenmerk is van sommige vormen van kanker 8,9. Hypersialylering hangt ook af van een verhoogde expressie van specifieke enzymen zoals N-acetylglucosaminyltransferase (GNT-V), dat hypersialylated tri- en/of tetra-antenne N-gebonden glycanen genereert, die in verband zijn gebracht met kankergroei en metastase10. Het siaalzuurgehalte reguleert ook de stabiliteit en functie van eiwitten, die essentieel zijn voor de rol van relevante oncogene spelers11. Daarom kan verhoogde sialylering de ontwikkeling van tumoren, metastase, resistentie tegen geneesmiddelen en immuunontwijking vergemakkelijken. Bovendien stelt de opregulatie van sialoglycanen tumoren in staat om te interageren met remmende Siglec-receptoren op immuuncellen en immuunsurveillance te vermijden. Om die reden worden sialoglycanen nu beschouwd als glyco-immuuncontrolepunten en aantrekkelijke therapeutische doelen. Remmers van de Siglec-immuunas bevinden zich bijvoorbeeld al in vroege klinische onderzoeken, aangezien de immuuncelreceptor Siglec (sialiczuurbindende immunoglobuline-achtige LECtin) een immuunremmende rol speelt12.

Enzymen zijn gebruikt om het glycaanprofiel te moduleren als hulpmiddelen voor studie of voor therapeutische strategieën13,14. Sialidase is gebruikt om de maligniteit van kankercellen te veranderen, aangezien gesialyleerde glycanen zoals sialyl Lewis X van cruciaal belang zijn voor celmigratie en kankermetastase15. Tegelijkertijd hebben sialidaseremmers, die de siaalzuursplitsing belemmeren, klinieken bereikt voor de behandeling van siaalzuurafhankelijke virale infecties16. Onlangs heeft siaalzuurmodulatie verdere belangstelling gekregen vanwege de cruciale rol van siaalzuren als liganden in de Siglec-immuunas, wat betekent dat ze nieuwe middelen bieden om de ontsnapping van kanker aan immuunresponsen te verminderen. Deze interesse werd verder versterkt door de bijdrage van Nobelprijswinnaar Bertozzi 2022 en haar team aan verschillende strategieën die selectief verschillende sialogylanen splitsen en de immuunrespons tegen kanker verbeteren17. Op sialidase gebaseerde strategieën vormen dus een veelbelovende modaliteit voor glyco-immuun checkpointtherapie. Het glycofenotype van cellen van het immuunsysteem is afhankelijk van het type cel en hun activeringsstatus. Wat T-cellen betreft, spelen glycanen een sleutelrol in de pathofysiologische stappen van T-celontwikkeling en thymocytenselectie, T-celactiviteit, differentiatie en proliferatie18. Polylactosamine op glycoproteïnen beïnvloedt bijvoorbeeld de basale niveaus van B-lymfocyten en T-lymfocyten en de activering van macrofagen19. In macrofagen spelen verschillende glycaanexpressiepatronen een belangrijke rol bij de rekrutering van macrofagen naar de micro-omgeving van de tumor (TME)20. Daarom zou de expressie van O-gebonden en N-gebonden glycanen door immuuncellen kunnen worden gebruikt als potentiële glycobiomarkers voor therapeutische benaderingen bij de behandeling van kanker en auto-immuunziekten.

Dendritische cellen (DC’s) zijn specifieke antigeenpresenterende cellen met een uniek vermogen om immuunresponsen op te wekken, zoals immuniteit tegen kanker21. DC’s moeten een opregulatie ondergaan van hun antigeenpresenterende MHC-moleculen om antigenen aan T-cellen te presenteren (signaal 1), co-stimulerende moleculen om T-cellen te activeren (signaal 2) en pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-12, om type 1 helper T-celproliferatie op gang te brengen (signaal 3)22. Het resulterende immuunprofiel is strak gereguleerd en controlepunten zijn essentieel om te voorkomen dat gezonde cellen worden aangevallen. Omdat DC’s verschillende immuunresponsen tegen tumorcellen kunnen stimuleren, worden ze gebruikt als celgebaseerde vaccins, en een aanzienlijk aantal klinische onderzoeken hebben hun potentiële voordelen aangetoond23,24. Nadat de FDA in 2010 het eerste op DC gebaseerde vaccin goedkeurde25,26, zijn er veel andere op DC gebaseerde vaccins ontwikkeld. Op gelijkstroom gebaseerde vaccins worden voornamelijk ex vivo geproduceerd en toegediend aan patiënten om immuunresponsen tegen tumoren op te wekken. Onvoldoende of korte rijping is momenteel echter een van de factoren die de klinische werkzaamheid van DC’s beperken en betekent dat dure cytokinecocktails moeten worden gebruikt. Zonder adequate rijping kunnen DC’s T-cellen niet activeren in klinische omstandigheden. In plaats daarvan brengen de DC’s immuuncontrolepunten tot expressie en veroorzaken ze een tolerogene immuunrespons die voorkomt dat cytotoxische T-cellen tegen tumorcellen werken.

Menselijke DC’s hebben sterk gesiaalyleerde oppervlakken en deze sialylering neemt af bij rijping en tijdens een algehele immuunrespons27. De rijping van DC’s kan worden geïnduceerd door deze siaalzuren te elimineren met sialidase. Desialylering reguleert verschillende cytokines, waaronder IL-12, sterk als gevolg van de translocatie van de NF-kB-transcriptiefactor naar de kern 6,28. Bovendien verbetert desaylering de kruispresentatie van antigeen via MHC-I en antitumor-immuunresponsen29,30. Dienovereenkomstig genereert de knock-out van de sialyltransferasen ST3Gal.l en ST6Gal.l, die een belangrijke rol spelen bij DC-sialylering, een volwassener fenotype in DC’s van muizen31.

Behandeling met Sialidase biedt een methode om alle aspecten van DC-rijping te stimuleren, inclusief verhoogde antigeenpresentatie, verhoogde expressie van co-stimulerende moleculen en verhoogde cytokineproductie, om de bovengenoemde tekortkomingen aan te pakken en DC’s in staat te stellen effectieve reacties op te wekken. Dit artikel presenteert een procedure om levensvatbare gedesatyleerde menselijke DC’s te verkrijgen door het gebruik van een bacteriële sialidase. Gedesialyleerde DC’s vertonen een verbeterd rijpingsprofiel en kunnen worden gebruikt als celmodellen om antitumorale immuunresponsen in vitro te stimuleren. De DC’s worden verkregen uit bloedmonocyten, die vervolgens in vitro worden gedifferentieerd di aanwezigheid van het cytokine interleukine-4 (IL-4) en granulocytmacrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF). Dit werk beschrijft ook op lectine gebaseerde methoden om siaalzuur aan het celoppervlak te analyseren en methoden om het DC-rijpingsniveau te immunofenotyperen. De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om andere celtypen te desialyleren, waardoor een benadering wordt geboden om de rol van sialoglycanen te onderzoeken, die vitale glyco-immuuncontrolepunten zijn en relevant zijn bij immunomodulatie.

Protocol

Cellen werden geïsoleerd uit de buffy coats van gezonde anonieme bloeddonoren, die vrijwilligers waren die door de nationale bloedbank, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), werden geleverd nadat schriftelijke en geïnformeerde donortoestemming was verkregen (IMP.74.52.4). Het gebruik van bloed is goedgekeurd door de ethische commissie (IPST 30072015), overeenkomstig Richtlijn 2004/23/EG betreffende kwaliteits- en veiligheidsnormen voor het doneren, verkrijgen, testen, bewerken, preserveren, bewaren en distribueren van menselijke weefsels en cellen (Portugese wet 22/2007, 29 juni). De IPST-biobank verzamelt en bewaart bloed in een specifieke plastic verzamelzak met citraatfosfaatdextrose (CPD), een conserverings- en antistollingsoplossing, om de integriteit van het bloed te behouden tot de verwerking. Om te beoordelen of het biologisch materiaal geschikt is voor manipulatie, wordt een serologische controle uitgevoerd voor Treponema pallidum, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en humaan immunodeficiëntievirus (HIV), die allemaal negatief moeten zijn. Voor het huidige onderzoek werd de buffy coat door IPST verstrekt voor onderzoeksdoeleinden, samen met informatie over de afnamedatum, serologische resultaten, bloedgroep en leeftijd van de donor32. De buffy coat kan maximaal 1 dag op kamertemperatuur blijven. 1. Het verkrijgen van dendritische cellen afkomstig van monocyten OPMERKING: Het is belangrijk om te vermelden dat wanneer menselijk perifeer bloed wordt gemanipuleerd, men rekening moet houden met specifieke universele veiligheidsmaatregelen en de juiste verwijdering van materiaal. Controleer voordat u begint of alle benodigde reagentia en materialen zijn voorbereid en klaar voor gebruik. Isolatie van mononucleaire cellen in perifeer bloedToegang tot de menselijke buffy coat.OPMERKING: Buffy coat is een bijproduct dat is afgeleid van bloed dat is verzameld via leukaferese32, dat door centrifugatie wordt verrijkt met witte bloedcellen. Alle stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met verticale stroomkamer (BSC). Open de buffy coat-verpakking door de verzegelde uitlaatbuis met een scalpel door te snijden en breng de inhoud over in een buis van 50 ml. Breng 7 ml buffy coat-monster over per steriele conische buis van 15 ml en voeg 6 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om een voorbereidende wasbeurt uit te voeren. Deze eerste wasstap is nodig om het monster te reinigen van de aanzienlijke hoeveelheid rode bloedcellen (RBC) en plasma, zodat het monster wordt geoptimaliseerd voor gradiëntscheiding met een dichtheidsgradiëntmedium (zie de tabel met materialen). Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.100 x g in een centrifuge met zwenkrotor en met de rem uitgeschakeld (zie de materiaaltabel). Vang na het centrifugeren de leukocytensuspensie (de witte ring tussen het plasma en de rode bloedcellen) op met een pasteurpipet en breng deze over in een nieuwe steriele conische buis van 15 ml. Vul de leukocytensuspensie tot 10 ml met PBS om de volgende scheidingsstap te vergemakkelijken en meng door voorzichtig op en neer te pipetteren. Bereid de oplossing van het dichtheidsgradiëntmedium (dichtheid: 1.077 g/ml) voor: Doe 3 ml dichtheidsgradiëntmedium in een nieuwe steriele conische buis van 15 ml en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Voeg 5 ml van de verdunde leukocytensuspensie (uit stap 1.1.5) toe aan de conische buis met het dichtheidsgradiëntmedium (5:3) om de dichtheidsgradiëntscheiding uit te voeren. Voeg het monster langzaam toe, druppel voor druppel, met behulp van de buiswanden om te voorkomen dat het dichtheidsgradiëntmedium wordt verstoord. Gradiëntscheiding: Centrifugeer de dichtheidsgradiënt medium suspensie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 1.100 x g in een centrifuge met zwenkrotor en met de rem uit. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig de conische buizen uit de centrifuge. Na deze stap is een reeks goed gedefinieerde lagen zichtbaar, waaronder de volgende, beginnend vanaf de onderkant: een rode laag (RBC’s en granulocyten), dichtheidsgradiëntmedium, een dunne bleke laag perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en plasma. Verzamel de dunne laag PBMC’s met behulp van een pasteurpipet en vermijd het opnemen van het dichtheidsgradiëntmedium eronder of te veel plasma erboven. Plaats het PBMC-monster in een nieuwe conische buis van 50 ml, vul deze tot 25 ml met PBS en meng het monster door zachtjes op en neer te pipetteren. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 600 x g (normale rem) om de resterende cellen en het vuil weg te spoelen en gooi het supernatans weg door de buis voorzichtig om te keren.OPMERKING: Als er te veel besmetting met rode bloedcellen is, wat waarneembaar is wanneer de celkorrel of de buffy coat niet volledig is gescheiden of roodachtig lijkt, wordt aanbevolen om de resterende rode bloedcellen te lyseren. Voeg in dit geval 5 ml RBC-lysisbuffer toe (zie de materiaaltabel), meng grondig en incubeer gedurende 5 minuten. Vul tot 40 ml met PBS, centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 900 x g (normale rem) en gooi het supernatans weg door de buis voorzichtig om te keren. Vul het monster tot 10 ml met PBS en neem een aliquot om de cellen te tellen. Om bloedplaatjes te verwijderen, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 x g (normale rem) en gooit u het supernatans weg door de buis voorzichtig om te keren.OPMERKING: Als er een aanzienlijk aantal bloedplaatjes is, centrifugeer dan tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op 200 x g (normale rem). De bloedplaatjes worden geïdentificeerd door het monster te visualiseren tijdens het tellen van de cellen. Isolatie van monocyten door immunomagnetische scheidingBereid de microbeads buffer voor door PBS aan te vullen met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Steriliseer de oplossing door filtratie (0,2 μm) en bewaar de buffer gekoeld (2-8 °C). Voer monocyt CD14+ isolatie uit door magnetisch geactiveerde celsortering (MACS).Bereken na het tellen van de cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller (stap 1.4.1) het juiste volume microbeadsbuffer en CD14 immunomagnetische bolletjes (zie de materiaaltabel). Zorg ervoor dat deze oplossingen in de ijskast worden gehouden. Voeg 80 μL microbeads buffer toe per 1 x 10 7 cellen en 20 μL CD14 peads per 1 x 107 cellen. Resuspendeer de celpellet in de eerder bepaalde volumes en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C (2-8 °C).OPMERKING: Als verificatie van de monocytenniveaus in de PBMC-monsters nodig is, voer dan een flowcytometrische analyse uit met behulp van kleuringsantilichamen (bijv. CD14 [Monoklonaal TÜK4]). Volg stap 3.2 voor meer informatie over de flowcytometrische analyse. Voeg 1-2 ml microbeads buffer toe per 1 x 107 cellen, centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 600 x g (normale rem) om ongebonden kralen te verwijderen en gooi het supernatans weg door de buis voorzichtig om te keren. Bereid de LS-kolom voor. De LS-kolommen bevatten ferromagnetische bolletjes die, wanneer ze op een magneet worden geplaatst, een positieve, zachte retentie van magnetisch gelabelde cellen mogelijk maken33. Plaats direct voor gebruik een LS-kolom (zie de materiaaltabel) op de magneet, spoel af met 3 ml microbeads buffer zonder volledig te drogen en ga onmiddellijk door naar de volgende stap.NOTITIE: Laat de kolom nooit uitdrogen tijdens de procedure om de opbrengst niet in gevaar te brengen. Resuspendeer de celpellet in 500 μL microbeadsbuffer per 1 x 108 cellen. Als het celgetal hoger is dan 4 x 108, gebruik dan een celzeef van 40 μm om celaggregatie te voorkomen. Voeg de celsuspensie toe aan de kolominlaat, plaats een conische buis van 15 ml onder de kolomuitlaat om de negatieve celfractie op te vangen en was de kolom drie keer met 3 ml microbeadsbuffer. De negatieve fractie bestaat uit de cellen die niet met de CD14-korrels zijn verzameld (d.w.z. de CD14− -cellen). Verwijder na de laatste wasbeurt de kolom van de magneet, plaats deze op een steriele conische buis van 15 ml, pipetteer 5 ml microbeads buffer in de kolominlaat en steek de zuiger van de spuit onmiddellijk in de kolominlaat en druk om de doelcellen af te geven. Verzamel de magnetisch gelabelde cellen (CD14+- cellen) en neem een aliquot om de cellen te tellen, zoals beschreven in stap 1.4.1. Centrifugeer beide celfracties, CD14− en CD14+ cellen, bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 600 x g (normale rem). Gooi de supernatant weg, bewaar de CD14+ -fractie voor de volgende stappen en bewaar de CD14−-fractie voor toekomstige tests, zoals co-cultuurtests , indien nodig. Indien nodig kunnen de cellen uit de CD14− -fractie worden gecryopreserveerd in RPMI-1640 20% FBS en 10% DMSO bij -80 °C. Monocytendifferentiatie in dendritische cellenBereid een compleet RPMI-1640-medium voor door het RPMI-1640-basismedium (met 11,1 mM glucose) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% van 2 mM L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% natriumpyruvaat en 1% van 100 μg/ml penicilline/streptomycine (zie de materiaaltabel). Voer monocytdifferentiatie uit in mo-DC’s, wat plaatsvindt gedurende ~5-6 dagen.Bereken het volume van het medium dat nodig is voor het aantal verkregen CD14+ -cellen en plaats de cellen volgens de volgende experimentopstelling.OPMERKING: In dit protocol werden de cellen geplateerd in een concentratie van 1,3 x 106 cellen/ml om rekening te houden met celdood en meetfouten, en het medium werd bereid door 1.000 E/ml GM-CSF en 750 E/ml IL-4 (zie de tabel met materialen) toe te voegen aan een compleet medium en dit grondig te mengen. Voeg het juiste volume medium toe aan de CD14+- cellen en resuspendeer door op en neer te pipetteren met een pasteurpipet. Plaat de celsuspensie in platen met 24 putjes (per putje: 1,3 x 106 cellen/ml) en incubeer in een kweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 . Verander het kweekmedium en vul het elke 2-3 dagen aan met verse cytokines (meestal eenmaal per differentiatieproces). Om dit uit te voeren, verwijdert u voorzichtig de helft van het kweekmedium zonder de cellen te verstoren. Voeg dezelfde hoeveelheid vers medium met de juiste concentratie cytokines toe, zoals eerder beschreven in de noot bij stap 1.3.2.1, en incubeer gedurende de resterende differentiatieperiode.OPMERKING: DC’s zijn, wanneer ze differentiëren van monocyten, losjes hechtende cellen. Volledig gedifferentieerde onrijpe mo-DC’s zijn spoelvormige, vrij zwevende en losjes hechtende cellen. De cellen kunnen ook rozetten vormen, vooral als ze volwassenzijn 34. Om de cellen na differentiatie te verzamelen, gebruikt u een micropipet om de volledige celsuspensie over te brengen in een steriele conische buis en wast u de putjes van de plaat twee keer met PBS, waarbij u zachtjes op de bodem tikt (Figuur 1A).OPMERKING: Vermijd het verzamelen van de sterk hechtende cellen, aangezien dit waarschijnlijk macrofagen zijn. Om onjuiste celrijping of -activering te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de cellen met uiterste zorg worden behandeld. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 180 x g (normale rem) om eventuele resten of dode cellen te verwijderen, en resuspendeer ze in het juiste medium/buffer voor de experimentele opstelling. Voer de rijping van mo-DC’s uit.In het geval dat de rijping van mo-DC’s vereist is, gebruik dan een putplaat of kolf, rekening houdend met het eerder gebruikte voorbeeld van de celconcentratie (1,3 x 10 6 cellen/ml), en dien een cytokinecocktail toe door het medium aan te vullen met een cytokinecocktail bestaande uit IL-1β (10 ng/ml),IL-6 (1.000 E/ml), prostaglandine E2 (PGE2; 1 μg/ml), en tumornecrosefactor-α (TNF-α; 10 ng/ml) (zie de materiaaltabel). Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur of 48 uur. Celtelling en levensvatbaarheidVoer celtellingen uit en probeer blauwe kleuring uit.Om het aantal cellen en de levensvatbaarheid van een celsuspensie te bepalen, neemt u een aliquot van 10 μl uit de celsuspensie en mengt u dit met 10 μl trypanblauw (1:1 verdunning). Neem 10 μL van het vorige mengsel en gebruik de geautomatiseerde cellenteller om het aantal cellen te tellen volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: Als de concentratie van cellen te hoog is, verdun dan het aliquot en houd na het tellen van de cellen rekening met de verdunningsfactor in de berekeningen. Pas het celnummer en medium/buffer aan voor de experimentele opstelling. Bepaal de levensvatbaarheid van de cel en apoptose30.OPMERKING: Bij dit werk werd na de behandeling met sialidase (sectie 2) de levensvatbaarheidstest uitgevoerd.Kleur de mo-DC’s met 5 μg/ml 7-aminoactinomycine D (7-AAD) en annexine V en bepaal de apoptose volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel). Analyseer de resultaten met behulp van flowcytometrie29,30. 2. Behandeling van de cellen met sialidase OPMERKING: Na de differentiatie in mo-DC’s, op de zesde dag, zijn de cellen klaar voor de sialidase-behandelingstest. Rekening houdend met de gewenste experimentele opstelling, verzamel ~ 10 x 10 6 mo-DC’s uit 10 putjes van de 24-wells platen met 1,3 x 106 cellen/well, en breng ze over in een nieuwe steriele 15 ml conische buis.OPMERKING: Ga uit van enig celverlies; in dit stadium is de gevonden concentratie doorgaans 1,3 x 106 cellen/ml omdat de mo-DC’s en hun voorlopers zich niet vermenigvuldigen en 20% levensvatbaarheidsverlies ervaren tijdens differentiatie in mo-DC’s. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5-7 minuten bij 300 x g (normale rem) en gooi het supernatans weg om dode cellen en vuil te verwijderen. Voeg 10 ml RPMI-1640-medium toe (met 11,1 mM glucose), centrifugeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g (normale rem), gooi het supernatant weg, voeg 2 ml RPMI-1640 toe en meng grondig. Plaats 1 ml cellen in RPMI-1640 in nieuwe steriele microbuisjes, #1 en #2; Elke microbuis bevat ongeveer 5 x 106 cellen. Voeg aan microbuis #1 500 mU sialidase van Clostridium perfringens toe (zie de Tabel met materialen). Voeg aan microtube #2 nagebootst behandeld sialidase toe, wat een negatieve controle is, om te bevestigen of de waargenomen effecten direct verband houden met de verwijdering van siaalzuur en niet te wijten zijn aan artefacten. De nepbehandelde sialidase is warmte-geïnactiveerde sialidase, die wordt verkregen door het enzym gedurende 20 minuten bij 100 °C te koken. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C. Plaats de cellen na incubatie in nieuwe steriele conische buisjes van 15 ml met dezelfde nummering, #1 en #2. Voeg ongeveer 4 ml compleet RPMI-1640-medium (met 10% FBS) toe aan beide buisjes om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g (normale rem) en gooi het supernatant weg. Voeg 5 ml compleet RPMI-1640-medium toe aan elke buis en plaats 1 ml cellen per putje. 3. Bepaling van het siaalzuurprofiel Lectine kleuringVerzamel en was de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 300 x g (normale rem). Resuspendeer de cellen in RPMI-1640 + 10% FBS en verdeel de cellen (100.000/100 μL) in de microbuisjes. Voer kleuring uit voor flowcytometrie in RPMI-1640 met 10% FBS met een concentratie van 0,01 mg/ml voor elke lectine: Sambucus nigra (SNA) lectine, pindaagglutinine (PNA) lectine en Maackia amurensis (MAA) lectine (zie de tabel met materialen). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Was de cellen met 1 ml PBS met 10% FBS of 10% BSA en centrifugeer ze gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g (normale rem). Voeg aan de cellen die zijn gekleurd met de gebiotinyleerde lectines 0,0005 mg/ml streptavidine-PE toe (zie de materiaaltabel) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen met 1 ml PBS en centrifugeer ze gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g (normale rem). Gooi het supernatant weg en voeg aan elk buisje 300 μL 2% paraformaldehyde (PFA 2%) toe. Bescherm de buizen tegen licht en bewaar ze indien nodig bij 4 °C tot de data-acquisitie. Verkrijg de gegevens met behulp van een flowcytometer binnen 1 week na monstervoorbereiding29,30. FlowcytometrieResuspendeer de cellen in 1 ml PBS en verkrijg het monster met een flowcytometer voor onmiddellijke gegevensverzameling. Voor vertraagde gegevensverzameling, resuspenderen in 300 μL 2% PFA en de gegevens binnen 1 week verkrijgen. Confocale laserscanmicroscopieBekleed de cellen met een polylysine-gecoate glazen dekglaasjes met een diameter van 12 mm en incubeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de dekglaasjes gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 100 x g (normale rem) om de celhechting te bevorderen. Fixeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten met 4% PFA voor het wassen met 1% BSA in PBS. Gebruik FITC-geconjugeerd SNA-lectine (0,01 mg/ml) om α2,6-gebonden siaalzuren op de celoppervlakken te kleuren (zie de materiaaltabel). Maak beelden met een confocale microscoop (zie de tabel met materialen). Selecteer na de verwerking van de Z-stack representatieve confocale dwarsdoorsnedebeelden. Kwantificeer de kleuringsintensiteit analytisch met behulp van de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF).OPMERKING: CTCF = Geïntegreerde dichtheid − (Oppervlakte van geselecteerde cel × Gemiddelde fluorescentie van achtergrondmetingen)29. 4. Rijpingsprofilering van mo-DC’s Antilichaamkleuring en flowcytometrieVerzamel een nieuw monster van de cellen van belang om antilichaamkleuring uit te voeren. Was de cellen gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op 300 x g (normale rem) en verdeel de cellen over de microbuisjes (100.000 cellen per buisje). Voer kleuring uit voor flowcytometrie met behulp van de gewenste antilichamen (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 en CD86 (zie de materiaaltabel). Incubeer de fluorescentie-geconjugeerde ab gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen met 1 ml PBS en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g (normale rem).OPMERKING: Als u niet-gelabelde ab gebruikt, voeg dan fluorescerend geconjugeerde secundaire ab toe en incubeer gedurende 15 minuten in het donker volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen met 1 ml PBS en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g (normale rem). Voeg aan alle microbuisjes maximaal 100 μL PBS toe, resuspendeer de cellen in 300 μL 2% paraformaldehyde (PFA 2%) en houd de buisjes in het donker bij 4 °C tot de data-acquisitie. Verkrijg de gegevens met behulp van een flowcytometer.OPMERKING: Na kleuring en fixatie kunnen de monsters onmiddellijk of binnen een periode van 1 week worden verkregen door middel van flowcytometrie. Bewaar de buizen in dit geval bij 4 °C in het donker. 5. Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) OPMERKING: In dit werk werd de IFN-γ-productie gemeten met behulp van de ELISA-assay volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel). Om de plaat in een coatingbuffer te coaten, verdunt u het afvangantilichaam (1:100, vangantilichaam in PBS), brengt u 100 μl van deze werkoplossing over naar elk putje en incubeert u het een nacht bij kamertemperatuur. Gooi het vangantilichaam volledig weg. Voeg de blokkeerbuffer toe (bijv. PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voordat u de blokkeerbuffer verwijdert. Voeg de standaard en het monster toe, met het respectievelijke mengsel en de verdunningen, en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was vijf keer met wasbuffer. Voeg het gebiotinyleerde detectorantilichaam toe en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door vijf wasbeurten. Voeg poly-HRP-streptavidin-HS toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door vijf wasbeurten met wasbuffer. Voeg TMB-substraat toe (zie de materiaaltabel) en incubeer gedurende maximaal 60 minuten bij kamertemperatuur, rekening houdend met het gebruikte testsysteem. Was vijf keer met wasbuffer. Lees de monsters af op een microplaatlezer bij 450 nm.

Representative Results

Monocytenisolatie en monocytdifferentiatie in mo-DC’sIn overeenstemming met het protocol werden menselijke PBMC’s geïsoleerd uit de buffy coat met behulp van dichtheidsgradiëntscheiding met dichtheidsgradiëntmedium en grondig gewassen. Trypanblauw werd gebruikt om levensvatbare celtellingen uit te voeren op de dag van isolatie, zoals eerder beschreven in stap 1.4.1. Vervolgens werd CD14+ monocytenisolatie uitgevoerd door middel van positieve selectie. Om dit te bereiken, werden PBMC’s geïncubeerd met magnetische kralen die een antilichaam bevatten dat het CD14-antigeen herkent. De geselecteerde CD14+ -monocyten werden gedurende 5-6 dagen27 gekweekt in een medium aangevuld met GM-CSF en IL-4 om te differentiëren in onrijpe mo-DC’s (Figuur 1A). De rijping van mo-DC’s kan worden verkregen door een cocktail van cytokines toe te passen, waaronder IL-6, IL-1β, TNF-α en PGE235 (Figuur 1A). Tijdens het differentiatieproces, als gevolg van IL-4- en GMCSF-stimulatie, wordt verwacht dat het celfenotype zal veranderen. Gegevens tonen aan dat mo-DC’s de expressie van oppervlaktemarker CD14 verliezen, voornamelijk tot expressie gebracht door monocyten (Figuur 1B), en significante expressie krijgen van CD1a, een marker die tot expressie wordt gebracht door menselijke DC’s36,37. mo-DC’s verkrijgen ook een hogere MHC-II (HLA-DR)-expressie, een antigeenpresenterend molecuul dat tot expressie wordt gebracht door menselijke DC’s en andere antigeenpresenterende cellen38 (Figuur 1B). Siaalzuurgehalte op het celoppervlakDe behandeling van mo-DC’s met sialidase vermindert het siaalzuurgehalte op het oppervlak van mo-DC’s, wat kan worden bevestigd door kleuring met lectines, dit zijn eiwitten die zich kunnen binden aan koolhydraten39. Omdat het gebruikte enzym zowel α2,3- als α2,6-gebonden siaalzuren van het celoppervlak verwijdert, werden mo-DC’s gekleurd met PNA, dat T-antigeen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Th herkent, evenals MAA- en SNA-lectines, die binden aan respectievelijk α2,3- en α2,6-sialic. De effectiviteit van de behandeling met sialidase werd geëvalueerd door middel van flowcytometrie en door confocale microscopie (figuur 2). Zoals te zien is in figuur 2A, verminderde behandeling met sialidase de MAA- en SNA-binding aanzienlijk, terwijl de PNA-kleuring toenam. De afname van SNA-kleuring na behandeling met sialidase werd verder bevestigd door confocale microscopie-analyse die een significant verminderde SNA-kleuring aan het celoppervlak liet zien (Figuur 2B). Functionele karakterisering van met sialidase behandelde mo-DC’sOm te evalueren hoe behandeling met sialidase de mo-DC-functies beïnvloedt, werd het rijpingsniveau van mo-DC’s beoordeeld na behandeling met sialidase. Zoals te zien is in figuur 3A, leidt de behandeling met sialidase tot een significante toename van de expressie van de antigeenpresenterende moleculen MHC I en MHC II en de expressie van de co-stimulerende moleculen CD80 en CD86. Om het effect van siaalzuurverwijdering op het vermogen van mo-DC’s om T-celresponsen te induceren te beoordelen, werden met sialidase behandelde mo-DC’s geladen met tumorcellysaten gebruikt om autologe T-cellen te primen (Figuur 3). Vervolgens werd het profiel van de resulterende T-cellen gekarakteriseerd op basis van hun vermogen om het Th1-cytokine IFN-γ af te scheiden. Zoals te zien is in figuur 3B, scheidden de T-cellen die werden geprimed door met sialidase behandelde mo-DC’s, in vergelijking met T-cellen die werden geprimed door volledig gesaalyleerde mo-DC’s, significant hogere niveaus van IFN-γ uit. Deze resultaten suggereren dat met sialidase behandelde mo-DC’s een verbeterd vermogen hebben om autologe T-cellen te primen. Levensvatbaarheid van de celNa behandeling met sialidase werd een levensvatbaarheidstest uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de behandeling niet cytotoxisch was voor de cellen. Na de behandeling werden mo-DC’s gekleurd met 7-AAD en Annexine V, om niet-levensvatbare en apoptotische cellen te detecteren, en geanalyseerd door middel van flowcytometrie (Figuur 4). De gegevens tonen geen significant verschil in cellevensvatbaarheid tussen onbehandelde (figuur 4, linkerpaneel) en met sialidase behandelde cellen (figuur 4, rechterpaneel). Figuur 1: Differentiatie van geïsoleerde monocyten in mo-DC’s. (A) CD14+-monocyten werden geïsoleerd uit buffy coats en gekweekt in een concentratie van 1,3 x 106 cellen/ml bij 37 °C. De monocyten werden gedifferentieerd in medium aangevuld met 750 E/ml IL-4 en 1.000 E/ml GM-CSF. Microscopische analyse van de morfologie van monocyten geïsoleerd uit menselijke buffy coat op dag 0 (bovenste afbeelding). Onvolwassen mo-DC’s; cellen werden gedifferentieerd gedurende een periode van 5 dagen met behulp van IL-4 en GM-CSF (middelste afbeelding). Gerijpte mo-DC’s werden verkregen door gebruik te maken van IL-6, IL-1β, TNF-α en PGE2-cytokines gedurende 24 uur (onderste afbeelding). Schaalbalken: 100 μm. (B) De cellen werden geanalyseerd op dag 0, dag 2 en dag 5 gedurende de differentiatieperiode met behulp van flowcytometrie. De volgende antilichamen werden gebruikt om markers op het celoppervlak te karakteriseren: (a-c) CD14; (d-f) CD1a, en (g-i) HLA-DR (MHC klasse II). De figuur toont representatieve histogrammen van ten minste drie onafhankelijke assays. Paneel (B) is gewijzigd van Videira et al.40, patent WO2017002045A1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Behandeling met sialidase van humane mo-DC’s om α2,6- en α2,3-gebonden siaalzuren van het celoppervlak te verwijderen. (A) Analyse van mo-DC’s door middel van flowcytometrie met behulp van lectinekleuring om de werkzaamheid van behandeling met sialidase te testen. Menselijke mo-DC’s werden behandeld met sialidase (grijze balken) of onbehandeld gelaten (witte balken) en gekleurd met SNA-lectine (herkennen van [2,6]-siaalzuren), MAA-lectine (herkennen van [2,3]-siaalzuren) en PNA-lectine (herkennen van T-antigeen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). De waarden vertegenwoordigen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van ten minste drie onafhankelijke tests. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige gepaarde t-toets (*P < 0,05 of ***P < 0,0001), verwijzend naar het verschil tussen de onbehandelde en met sialidase behandelde DC's. Behandeling met Sialidase verminderde de MAA-binding en verhoogde PNA-kleuring in menselijke mo-DC's, als gevolg van de verwijdering van α(2,3)-gebonden siaalzuren; de verwijdering van α(2,6)-gebonden siaalzuren na behandeling met sialidase werd gedetecteerd door een afname van SNA-kleuring. (B) Confocale microscopie van mo-DC’s die met sialidase zijn behandeld en ter observatie op dekglaasjes zijn bereid. Een reeks z-stack-afbeeldingen werd verzameld uit verschillende cellen en verwerkt om de gemiddelde kleuringsintensiteit op te nemen. Schaalbalken: 20 μm. Paneel (A) is aangepast van Silva et al.30; paneel (B) is aangepast ten opzichte van Silva et al.29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Behandeling met sialidase van mo-DC’s die een hogere expressie van rijpingsmarkers induceert. (A) met sialidase behandelde mo-DC’s vertoonden een hoger rijpingsfenotype dan volledig gesialyleerde mo-DC’s. Flowcytometrie werd gebruikt om de expressie van verschillende rijpingsmarkers te evalueren. De mo-DC’s werden gedurende 1 uur bij 37 °C behandeld met sialidase; de grafiekwaarden vertegenwoordigen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) (gemiddelde ± SEM) van ten minste drie onafhankelijke tests. Statistisch significante verschillen werden berekend met behulp van een t-toets (*P < 0,05, **P < 0,01), verwijzend naar het verschil tussen de onbehandelde en met sialidase behandelde aandoeningen. (B) Gedesialyleerde menselijke mo-DC’s geladen met antigenen van hele tumoren induceerden specifieke T-celresponsen. De mo-DC’s werden gedurende 1 uur bij 37 °C behandeld met sialidase of onbehandeld gelaten, gevolgd door belading met MCF-7-lysaten (TL) als bron van antigenen van hele tumorcellen. Co-kweek tussen mo-DC’s en autologe T-cellen werd gedurende 4-8 dagen uitgevoerd in aanwezigheid van IL-2 (10 E/ml). T-cellen geprimed met gedesaalyleerde mo-DC’s vertoonden een significant hogere secretie van het Th1-cytokine, IFN-γ. Na T-celstimulatie met mo-DC’s werden de cytokines die werden uitgescheiden in de co-cultuursupernatanten gemeten met ELISA (n = 7). De grafiekwaarden geven de concentratie (pg/ml) weer (gemiddelde ± SEM). Statistisch significante verschillen werden berekend met behulp van een t-toets (*P < 0,05). Het cijfer is aangepast ten opzichte van Silva et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Gebrek aan impact van behandeling met sialidase op de levensvatbaarheid van menselijke mo-DC’s. Onbehandelde mo-DC’s (linkerpaneel) en met sialidase behandelde mo-DC’s (rechterpaneel) werden onderworpen aan dubbele kleuring met annexine V en 7-AAD, en de kleuring werd geanalyseerd door middel van flowcytometrie. De gegevens toonden geen significant verschil in cellevensvatbaarheid tussen de onbehandelde en met sialidase behandelde cellen, wat suggereert dat mo-DC’s behandeling met sialidase kunnen verdragen en levensvatbaar blijven om hun immunologische functie uit te oefenen. Het cijfer is aangepast ten opzichte van Silva et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Isolatie van monocyten
Dit manuscript beschrijft een protocol om mo-DC’s te genereren uit mensgeïsoleerde monocyten CD14+ (Figuur 1A), gevolgd door het uitvoeren van een sialidasebehandeling om het siaalzuurgehalte op het oppervlak van deze cellen te verminderen.

Er zijn verschillende manieren om menselijke DC’s te verkrijgen, zoals rechtstreeks uit perifeer bloed of weefsels of door differentiatie van precursoren zoals stamcellen of monocyten. Het verkrijgen van DC’s die worden onderscheiden van monocyten die zijn geïsoleerd uit perifeer bloed is veel eenvoudiger vanwege het gemak waarmee grote hoeveelheden monocyten kunnen worden verkregen in vergelijking met andereDC-bronnen41. Maar om een hoog percentage geïsoleerde monocyten te verkrijgen, moeten alle protocolstappen zorgvuldig worden gevolgd. Het dichtheidsgradiëntmedium kan bijvoorbeeld giftig zijn voor de cellen, en om celdood te voorkomen, moet men langdurig celcontact met het dichtheidsgradiëntmedium vermijden en de cellen grondig wassen. Celmanipulatie moet zo snel mogelijk gebeuren om verlies van cellevensvatbaarheid te voorkomen. Uit PBMC’s kunnen monocyten worden geïsoleerd door positieve selectie met behulp van de magnetisch geactiveerde celsorteringsmethode (MACS), een geschikte technologie om een groot aantal monocyten op te leveren. Bovendien hebben mo-DC’s die zijn afgeleid van MACS-geïsoleerde monocyten, in vergelijking met andere monocytselectiemethoden, een groter vermogen om antitumor-T-celactiviteit te stimuleren42. In dit protocol werden de monocyten, eenmaal geïsoleerd, gedurende een periode van 5-6 dagen geïncubeerd met IL-4 en GM-CSF om de differentiatie in onrijpe mo-DC’s te bereiken (Figuur 1). De resultaten toonden aan dat morfologisch (Figuur 1A) en fenotypisch (Figuur 1B) de geïsoleerde monocyten differentieerden tot onrijpe mo-DC’s. Bovendien verloren de mo-DC’s tijdens de differentiatie de expressie van CD14-markers en kregen ze de expressie van CD1a en MHC-II (Figuur 1B), die nodig zijn voor de presentatie van antigeen aan T-cellen.

Deze isolatie en differentiatie van monocyten in mo-DC’s zijn beperkingen van dit protocol. Het isolatieproces is een gevoelige stap die zorgvuldig en snel moet worden uitgevoerd om celdood te voorkomen, en deze stap moet ook worden uitgevoerd telkens wanneer mo-DC’s nodig zijn voor een nieuw experiment. Het differentiatieproces duurt 5-6 dagen, wat een probleem vormt bij het gebruik van deze methode voor high-throughput analyses. Desalniettemin zijn de isolatiemethode en het gebruik van cytokines om mo-DC’s te differentiëren nuttig voor het genereren van een groot aantal functionele mo-DC’s in vitro voor experimenteerdoeleinden. De mo-DC’s die in dit protocol worden gegenereerd, kunnen een behandeling met sialidase, flowcytometrie, ELISA, confocale microscopie, enzovoort ondergaan, waardoor het belang en het nut van deze methode wordt benadrukt30.

Onrijpe mo-DC’s en behandeling met sialidase
Sialidasen zijn essentieel bij de regulatie van sialylering en zijn verantwoordelijk voor het verwijderen van siaalzuren uit de glycanen van het celoppervlak. In mo-DC’s leidt de verwijdering van siaalzuur door sialidase tot de rijping van deze cellen, wat de antigeen-kruispresentatie en de daaropvolgende T-celactivering en antitumoractiviteitverhoogt30.

Onrijpe menselijke mo-DC’s vertonen een hoog gehalte aan α(2,6)- en α(2,3)-gekoppelde siaalzuren op het celoppervlak27 in vergelijking met volwassen mo-DC’s31,43. Bovendien verbetert het verwijderen van siaalzuren door mo-DC’s te behandelen met sialidase de rijping van de DC’s 28,30,31. De sialidase die voor dit experiment werd geselecteerd, was afkomstig van de bacterie Clostridium perfringens. Toch produceren ook andere organismen sialidases, zoals de bacteriën Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae of Salmonella typhimurium44, de bloedzuiger Macrobdella decora45 en zelfs Homo sapiens46, en sialidasen van deze organismen worden ook experimenteel gebruikt. Elke sialidase heeft echter verschillende substraatspecificiteiten. Bovendien kan het gebruik van het sialidase-enzym zijn beperkingen hebben; zo kan de manipulatie van mo-DC’s tijdens de behandeling deze cellen verder stimuleren. Bovendien moeten de hoeveelheid sialidase en de incubatietijden worden geoptimaliseerd op basis van het type cellen dat wordt gebruikt en hun siaalzuursamenstelling. De verwijdering van siaalzuur is geen permanent effect, maar eerder een voorbijgaand fenomeen, omdat de cel het siaalzuurgehalte op het celoppervlak zal herstellen. Naast sialidase zijn er andere methoden om de siaalzuurmoleculen aan het oppervlak van cellen te verminderen, zoals het gebruik van sialyltransferaseremmers, genknock-outs van sialyltransferasegenen of metabole blokkade van siaalzuur met behulp van siaalzuurmimetica47,48,49. Desalniettemin kunnen deze methoden verschillende effecten op cellen hebben, en naast desialylatie moet rekening worden gehouden met de levensvatbaarheid van de cel. De behandeling met het sialidase-enzym is een praktische methode om siaalzuren op het celoppervlak effectief en tijdelijk te verwijderen met behoud van de levensvatbaarheid van de cel.

In dit werk werd sialidase toegevoegd aan de onrijpe mo-DC’s in een concentratie van 500 mU/5 x 106 cellen/ml, en de cellen werden gedurende 60 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De behandeling werd uitgevoerd met RPMI-1640 zonder serum om de levensvatbaarheid van de cel te behouden en elke interactie tussen de gesiaalyleerde moleculen in het serumte voorkomen 30. Behandeling met Sialidase kan worden uitgevoerd met andere buffers dan RPMI, zoals 50 mM natriumacetaat, pH 5,1 (in het geval van C. perfingens sialidase) of PBS50,51,52. Desalniettemin is RPMI-1640 het meest voorkomende kweekmedium voor DC’s, omdat het tijdens de procedure constante experimentele omstandigheden handhaaft, rijping vermijdt en eventuele stress vermindert die kan worden veroorzaakt door sialidasebuffers of PBS53,54,55,56. Na incubatie met sialidase is het van cruciaal belang om de cellen grondig te wassen met een medium met serumaanvulling om te garanderen dat de enzymreactie is gestopt. De aanwezigheid van gesiayleerde moleculen in het serum zal concurreren als substraten voor sialidase, waardoor een snelle reactiestop wordt gegarandeerd.

Karakterisering van oppervlaktemarkers door middel van flowcytometrie en confocale microscopie
Voor de bepaling van het siaalzuurprofiel hebben we in protocolsectie 3 gebruik gemaakt van lectinekleuring gevolgd door flowcytometrie en confocale laserscanmicroscopie. Voor de celkleuringsprocedure werden in beide gevallen de lectineconcentraties en incubatieomstandigheden geoptimaliseerd om celagglutinatie en dood te voorkomen. Het is van cruciaal belang om de incubatie bij 4 °C uit te voeren in buffers die ten minste 2% FBS of BSA bevatten om niet-specifieke binding van de lectines te voorkomen. In dit protocol werd RPMI-1640 met 10% FBS gebruikt om constante experimentele omstandigheden te handhaven en celstress te voorkomen. Wat confocale microscopie betreft, is fixatie van de cellen voorafgaand aan kleuring essentieel om de morfologie te behouden, autolyse te voorkomen en antigeniciteit te behouden.

De analyse van het mo-DC-fenotype door middel van flowcytometrie toonde aan dat met sialidase behandelde mo-DC’s een significant hogere hoeveelheid PNA-lectine gebonden hadden aan het celoppervlak in vergelijking met MMA- en SNA-lectines, die afnamen na de behandeling met sialidase (Figuur 2A). Zoals verwacht nam de PNA-kleuring toe, aangezien PNA niet-gesaalyleerde antigenen herkent, in tegenstelling tot MAA en SNA, die rechtstreeks binden aan respectievelijk α2,3- en α2,6-siaalzuren30. Deze kleuring bevestigt de effectieve verwijdering van siaalzuren van het celoppervlak met behulp van dit protocol. Een andere methode die kan worden gebruikt om de behandeling te valideren en het siaalzuurgehalte op het celoppervlak te analyseren, is lectinekleuring gevolgd door confocale microscopie, zoals geïllustreerd in figuur 2B.

Naast de eerste voorbeelden bestaan er alternatieve benaderingen om het siaalzuurgehalte te evalueren en te karakteriseren, zoals lectine-sondering door western blotting. Er zijn ook alternatieve siaalzuurspecifieke lectines beschikbaar, zoals Siglecs, een groep lectines die een duidelijke voorkeur hebben voor siaalzuursoorten en bindingen. Naast het gebruik van lectines in beide technieken (flowcytometrie, microscopie of western blot), is het ook mogelijk om het siaalzuurgehalte te karakteriseren met behulp van antilichamen; α2,8-siaalzuren kunnen bijvoorbeeld worden beoordeeld door antilichamen zoals kloon 735, dat specifiek is voor polysiaalzuur58. Bovendien kunnen cellen na behandeling met sialidase functioneel worden getest op hun biologische of therapeutische efficiëntie door hun fenotype en vermogen om T-cellen te activeren te evalueren40. In feite, zoals aangetoond in de gegeven voorbeelden, vertoonden met sialidase behandelde mo-DC’s een hoger maturatiefenotype, evenals een verhoogde expressie van antigeenpresenterende en co-stimulerende moleculen.

Bovendien kunnen met sialidase behandelde mo-DC’s worden geladen met antigenen en samen met T-cellen of andere cellen worden gekweekt en vervolgens worden bestudeerd met betrekking tot het fenotype, het cytokinesecretieprofiel of andere kenmerken. In het gegeven voorbeeld laten de gegevens zien dat met sialidase behandelde mo-DC’s kunnen worden geladen met tumorantigenen en vervolgens kunnen worden gebruikt om T-cellen te activeren. In feite vertoonden de resulterende T-cellen een verhoogde IFN-γ secretie, wat in overeenstemming is met eerdere rapporten over het effect van een tekort aan siaalzuur op het vergroten van het vermogen van mo-DC’s om T-cellen te activeren 27,28,29,30,31.

Concluderend toont dit protocol een haalbare, levensvatbare en praktische methode om mo-DC’s te genereren voor manipulatie van het siaalzuurgehalte door behandeling met sialidase. Dit protocol presenteert een methodologie die verschillende doelen en toepassingen kan dienen. Deze methode kan niet alleen een cruciale rol spelen bij het begrijpen van de rol van siaalzuren in de rijping en respons van immuuncellen, maar kan ook worden gebruikt als een immunomodulerend hulpmiddel.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de financiering van de Europese Commissie GLYCOTwinning GA 101079417 en EJPRD/0001/2020 EU 825575; de Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, in het kader van subsidies FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) en LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. en Stemmatters werden ook gefinancierd door de Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), via het Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) voor de SI I& DT DCMatters project (NORTE-01-0247-FEDER-047212). We erkennen de Biolabs-faciliteit bij FCT-NOVA en GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma – Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma – Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma – Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma – Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma – Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma – Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma – Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, &. #. 1. 9. 4. ;., et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012)
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 – Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -. Y., Li, S. -. C., Li, Y. -. T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta – Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes – Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Monocyte-derived Dendritic CellsSialylated PhenotypesGlycoimmunologySialylated GlycansGlycan Binding ProteinsGlycan ProfilingSialic Acid ContentDendritic Cell MaturationSialidase TreatmentImmune ResponseCancerCongenital Disorders Of Glycosylation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image