具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源的树突状细胞的生成

在获得书面和知情的献血者同意后，从健康的匿名献血者的血沉棕黄层中分离出细胞，这些献血者是由国家血库葡萄牙桑格和移植研究所（IPST）提供的志愿者（IMP.74.52.4）。根据关于人体组织和细胞捐赠、采购、测试、加工、保存、储存和分发的质量和安全标准的指令 2004/23/EC（葡萄牙法律 22/2007,6 月 29 日），伦理委员会 （IPST 30072015） 批准了血液使用。IPST生物样本库将血液收集并储存在含有柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）的特定塑料收集袋中，CPD是一种保存和抗凝固溶液，以保持血液的完整性，直到处理。为了评估生物材料是否适合操作，对 梅毒螺旋体、乙型肝炎病毒 （HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV） 和人类免疫缺陷病毒 （HIV） 进行血清学控制，所有这些都必须为阴性。在本研究中，IPST 提供了血沉棕黄层用于调查目的，以及有关采集日期、血清学结果、血型和供体年龄的信息32.血沉棕黄层在室温下最多可以保存 1 天。 1. 获得单核细胞来源的树突状细胞 注意：值得一提的是，当人类外周血纵时，应考虑特定的通用安全预防措施和适当的材料处置。在开始之前，确认所有必要的试剂和材料都已准备好并可以使用。 外周血单核细胞的分离进入人类血沉棕黄的外套。注：血沉棕黄层是来自通过白细胞分离术32 收集的血液的副产品，通过离心富集在白细胞中。所有步骤均在垂直流动室生物安全柜（BSC）中进行。 用手术刀切开密封的出口管，打开血沉棕黄涂层包装，然后将内容物转移到 50 mL 管中。每个无菌 15 mL 锥形管转移 7 mL 血沉棕黄层样品，并加入 6 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS） 进行初步洗涤。为了从大量红细胞 （RBC） 和血浆中清除样品，该初始洗涤步骤是必要的，以便使用密度梯度培养基优化样品进行梯度分离（参见 材料表）。 在室温下以1,100× g 离心管在具有摆动转子并关闭制动器的离心机中离心10分钟（参见 材料表）。 离心后，用巴斯德移液管收集白细胞悬浮液（血浆和红细胞之间的白环），并将其转移到新的无菌 15 mL 锥形管中。 用 PBS 填充至 10 mL 的白细胞悬浮液以帮助下一步分离，并通过轻轻上下移液进行混合。 制备密度梯度培养基（密度：1.077 g/mL）溶液：将 3 mL 密度梯度培养基放入新的无菌 15 mL 锥形管中，使其加热至室温。 将5mL稀释的白细胞悬浮液（来自步骤1.1.5）加入含有密度梯度培养基（5：3）的锥形管中，以进行密度梯度分离。使用管壁缓慢、逐滴添加样品，以避免干扰密度梯度介质。 梯度分离：在室温下以1,100× g 离心密度梯度培养基悬浮液在带有摆动转子并关闭制动器的离心机中离心30分钟。 离心后，小心地从离心机中取出锥形管。在此步骤之后，可以看到一系列定义明确的层，包括以下内容，从底部开始：红色层（红细胞和粒细胞）、密度梯度培养基、外周血单核细胞 （PBMC） 的薄层苍白和血浆。 使用巴斯德移液管收集薄层PBMC，并避免吸收下方的密度梯度介质或上方过多的血浆。将 PBMC 样品放入新的 50 mL 锥形管中，用 PBS 填充至 25 mL，然后轻轻上下移液混合样品。 将样品在室温下以600× g （正常制动器）离心10分钟以洗去残留的细胞和碎片，并通过小心地倒置试管弃去上清液。注意：如果红细胞污染过多，当细胞沉淀或血沉棕黄层未完全分离或呈红色时，建议裂解剩余的红细胞。在这种情况下，加入 5 mL RBC 裂解缓冲液（参见 材料表），充分混合，孵育 5 分钟。用PBS填充至40mL，在室温下以900× g （正常制动）离心样品10分钟，并通过小心地倒置试管弃去上清液。 用PBS填充样品至10mL，并取等分试样对细胞进行计数。为了除去血小板，在室温下以400× g （正常制动）离心5分钟，并通过小心地倒置管弃去上清液。注意：如果有大量血小板，则在室温下以200× g （正常制动）离心10分钟两次。通过在计数细胞的同时可视化样品来识别血小板。 通过免疫磁性分离分离单核细胞通过用 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 补充 PBS 来制备微珠缓冲液。通过过滤（0.2μm）对溶液进行灭菌，并将缓冲液冷藏（2-8°C）。 通过磁激活细胞分选 （MACS） 进行单核细胞 CD14+ 分离。使用自动细胞计数仪（步骤1.4.1）进行细胞计数后，计算所需的适当体积的微珠缓冲液和CD14免疫磁珠（参见材料表）。确保这些溶液保持在冰上。每 1 x 10 7 个细胞加入 80 μL 微珠缓冲液，每 1 x 107 个细胞加入 20 μL CD14 微珠。 将细胞沉淀重悬于先前确定的体积中，并在4°C（2-8°C）下孵育15分钟。注意：如果需要验证PBMC样品中的单核细胞水平，请使用染色抗体（例如CD14 [单克隆TÜK4]）进行流式细胞术分析。按照步骤3.2了解流式细胞术分析的详细信息。 每 1 x 107 个细胞加入 1-2 mL 微珠缓冲液，在室温下以 600 x g （正常制动）离心 10 分钟以除去未结合的珠子，并通过小心倒置管弃去上清液。 准备 LS 色谱柱。LS 色谱柱包含铁磁球，当放置在磁铁上时，可以积极、温和地保留磁性标记的细胞33。使用前，将 LS 色谱柱（参见 材料表）放在磁铁上，用 3 mL 微珠缓冲液冲洗，不要完全干燥，然后立即进行下一步。注意：切勿在操作过程中让色谱柱变干，以免影响产量。 将细胞沉淀重悬于每 1 x 108 个细胞的 500 μL 微珠缓冲液中。如果细胞数高于 4 x 108，请使用 40 μm 细胞过滤器以防止细胞聚集。 将细胞悬液加入色谱柱入口，在色谱柱出口下方放置一个15 mL锥形管以收集阴性细胞部分，并用3 mL微珠缓冲液洗涤色谱柱三次。阴性部分包括未用 CD14 珠收集的细胞（即 CD14− 细胞）。 最终洗涤后，从磁铁上取下色谱柱，将其置于无菌的 15 mL 锥形管上，将 5 mL 微珠缓冲液移液到色谱柱入口中，然后立即将注射器柱塞插入色谱柱入口并推动以分配目标细胞。 收集磁性标记的细胞（CD14 + 细胞），并取等分试样对细胞进行计数，如步骤1.4.1所述。 将两种细胞组分，CD14 – 和CD14 +细胞在室温下以600×g离心10分钟（正常制动）。弃去上清液，保留CD14 +级分用于后续步骤，并储存CD14 – 级分用于将来的测定，如必要时共培养测定。如果需要，CD14 – 部分的细胞可以在-80°C下冷冻保存在RPMI-1640 20S和10%DMSO中。 单核细胞分化为树突状细胞通过用 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸 （NEAA）、1% 丙酮酸钠和 1% 的 100 μg/mL 青霉素/链霉素补充 RPMI-1640 基础培养基（含有 11.1 mM 葡萄糖）来制备完整的 RPMI-1640 培养基（参见 材料表）。 将单核细胞分化为 mo-DC，这发生在 ~5-6 天内。计算获得的CD14 + 细胞数量所需的培养基体积，并根据以下实验设置铺板细胞。注：在该方案中，细胞以1.3×106 个细胞/ mL的浓度接种，以考虑细胞死亡和测量误差，并通过将1,000 U / mL GM-CSF和750 U / mL IL-4（参见 材料表）加入完全培养基中并充分混合来制备培养基。 向CD14+ 细胞中加入适当体积的培养基，并用巴斯德移液管上下移液重悬。将细胞悬液铺入24孔板（每孔：1.3×106 个细胞/ mL）中，并在37°C的培养箱中用5%CO2孵育。 更换培养基，每 2-3 天补充一次新鲜细胞因子（通常每个分化过程一次）。为此，小心地去除一半的培养基，不要干扰细胞。如前面步骤1.3.2.1的注释所述，加入相同量的具有适当浓度的细胞因子的新鲜培养基，并孵育剩余的分化期。注意：DCs从单核细胞中分化出来时，是松散贴壁的细胞。完全分化的未成熟 mo-DC 是纺锤形、自由漂浮且贴壁松散的细胞。细胞也可能形成莲座，尤其是在成熟时34. 为了在分化后收集细胞，使用微量移液管将整个细胞悬浮液转移到无菌锥形管中，并用PBS洗涤板的孔两次，轻轻敲击底部（图1A）。注意：避免收集大量贴壁细胞，因为这些可能是巨噬细胞。为避免细胞成熟或活化不当，请确保格外小心地处理细胞。 在室温下以180× g （正常制动）离心细胞10分钟以除去任何残留物或死细胞，并重悬于适当的培养基/缓冲液中用于实验设置。 执行 mo-DC 的成熟。如果需要 mo-DC 的成熟，使用孔板或烧瓶，同时考虑到先前使用的细胞浓度示例（1.3 x 10 6 个细胞/mL），并通过补充含有 IL-1β （10 ng/mL）、IL-6 （1,000 U/mL）、前列腺素 E2 （PGE2; 1 μg/mL） 的细胞因子混合物来施用细胞因子混合物， 和肿瘤坏死因子-α （TNF-α; 10 ng/mL）（参见 材料表）。将细胞在37°C下用5%CO2 孵育24小时或48小时。 细胞计数和活力进行细胞计数和台盼蓝染色。要确定细胞数和细胞悬液的活力，请从细胞悬液中取出 10 μL 的等分试样，并将其与 10 μL 台盼蓝（1：1 稀释度）混合。 取 10 μL 先前的混合物，然后根据制造商的说明使用自动细胞计数仪计数细胞数。注意：如果细胞浓度过高，请稀释等分试样，细胞计数后，在计算中考虑稀释因子。 调整实验设置的细胞数和培养基/缓冲液。 确定细胞活力和凋亡30.注：在这项工作中，在唾液酸酶处理（第2节）之后，进行活力测定。用5μg/ mL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）和膜联蛋白V染色mo-DC，并根据制造商的说明测定细胞凋亡（参见 材料表）。 使用流式细胞术分析结果29,30。 2.用唾液酸酶处理细胞 注意：分化成mo-DC后，在第六天，细胞准备好进行唾液酸酶处理测定。 考虑到所需的实验设置，从 1.3 x 10 6 个细胞/孔的 24 孔板的 10 个孔中收集 ~10 x 106 mo-DC，并将它们转移到新的无菌 15 mL 锥形管中。注意：假设一些细胞损失;通常，在此阶段，发现的浓度为 1.3 x 106 个细胞/mL，因为 mo-DC 及其前体在分化为 mo-DC 的过程中不会增殖并经历 20% 的活力损失。 在室温下以300× g 离心5-7分钟（正常制动），弃去上清液以除去死细胞和碎片。 加入 10 mL RPMI-1640 培养基（含 11.1 mM 葡萄糖），在室温下以 300 x g （正常制动）离心 4 分钟，弃去上清液，加入 2 mL RPMI-1640，并充分混合。 将 RPMI-1640 中的 1 mL 细胞放入新的无菌微管 #1 和 #2 中;每个微管将包含大约 5 x 106 个细胞。 向微管 #1 中加入 500 mU 产 气荚膜梭菌唾液酸酶（参见 材料表）。向微管 #2 中加入模拟处理的唾液酸酶，这是一种阴性对照，以确认观察到的效果是否与唾液酸去除直接相关，而不是由于伪影。模拟处理的唾液酸酶是热灭活的唾液酸酶，其通过在100°C下将酶煮沸20分钟而获得。 在37°C孵育60分钟。 孵育后，将细胞放入新的无菌 15 mL 锥形管中，编号相同，#1 和 #2。向两个试管中加入约 4 mL 完全 RPMI-1640 培养基（含有 10% FBS）以停止酶促反应。 在室温下以300× g （正常制动）离心4分钟，弃去上清液。 向每个试管中加入 5 mL 完全 RPMI-1640 培养基，每孔铺板 1 mL 细胞。 3. 唾液酸谱的测定 凝集素染色收集细胞并在室温下以300× g （正常制动）洗涤5分钟。 将细胞重悬于RPMI-1640 + 10S中，并将细胞（100,000 / 100μL）分配到微管中。 使用浓度为0.01mg / mL的每种凝集素在RPMI-1640中用10S进行流式细胞术染色： 接骨木 （SNA）凝集素，花生凝集素（PNA）凝集素和 Maackia amurensis （MAA）凝集素（参见 材料表）。在4°C孵育30分钟。 用含有10S或10%BSA的1mL PBS洗涤细胞，并在室温下以300× g 离心4分钟（正常制动）。 向用生物素化凝集素染色的细胞中，加入0.0005mg / mL链霉亲和素-PE（参见 材料表），并在室温下在黑暗中孵育15分钟。用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 x g （正常制动）离心 4 分钟。 弃去上清液，向每个试管中加入 300 μL 2% 多聚甲醛 （PFA 2%）。保护管免受光照，如果需要，储存在4°C直至数据采集。 在样品制备后1周内使用流式细胞仪采集数据29,30。 流式细胞术将细胞重悬于 1 mL PBS 中，并用流式细胞仪采集样品以立即采集数据。 对于延迟的数据采集，重悬于300μL的2%PFA中，并在1周内采集数据。 激光共聚焦扫描显微镜将细胞铺在直径为12mm的聚赖氨酸涂层玻璃盖玻片上，并在室温下孵育5分钟。 在室温下以100× g （正常制动）离心盖玻片1分钟以促进细胞粘附。 在室温下用4%PFA固定30分钟，然后用PBS中的1%BSA洗涤。 使用FITC偶联的SNA凝集素（0.01mg / mL）对细胞表面的α2,6-连接的唾液酸进行染色（参见 材料表）。 在共聚焦显微镜上获取图像（参见 材料表）。 Z-stack处理后，选择具有代表性的共聚焦截面图像。 使用校正后的总细胞荧光 （CTCF） 分析量化染色强度。注：CTCF = 积分密度 − （所选细胞面积 × 背景读数的平均荧光）29. 4. mo-DCs的成熟谱 抗体染色和流式细胞术收集目标细胞的新样本以进行抗体染色。在室温下以300× g （正常制动）洗涤细胞5分钟，并将细胞分布到微管中（每管100,000个细胞）。 使用所需的抗体（ab），MHI-I，MHC-II，CD80和CD86进行流式细胞术染色（参见 材料表）。 将荧光偶联的抗体在室温下在黑暗中孵育15分钟。 用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 x g（正常制动）离心 5 分钟。注意：如果使用未标记的抗体，请加入荧光偶联的二级抗体，并按照制造商的说明在黑暗中孵育15分钟。用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 x g （正常制动器）离心 5 分钟。 向所有微管中加入多达100μL的PBS，将细胞重悬于300μL的2%多聚甲醛（PFA 2%）中，并将试管保持在4°C的黑暗中，直到数据采集。 使用流式细胞仪采集数据。注：染色和固定后，可以立即或在1周内通过流式细胞术获取样品。在这种情况下，将试管在4°C的黑暗中储存。 5. 酶联免疫吸附试验（ELISA） 注：在这项工作中，按照制造商的说明使用ELISA测定法测量IFN-γ的产生（参见 材料表）。 为了在包被缓冲液中包被板，稀释捕获抗体（1：100，PBS中的捕获抗体），将100μL该工作溶液转移到每个孔中，并在室温下孵育过夜。 完全丢弃捕获抗体。 加入封闭缓冲液（例如，PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20），并在室温下孵育 1 小时，然后去除封闭缓冲液。 加入标准品和样品，以及各自的混合物和稀释液，并在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤五次。 加入生物素化检测抗体，在室温下孵育2小时，然后洗涤5次。 加入聚-HRP-链霉亲和素-HS，在室温下孵育30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤五次。 加入TMB底物（参见 材料表），并在室温下孵育长达60分钟，同时考虑到所使用的测试系统。用洗涤缓冲液洗涤五次。 在酶标仪上以 450 nm 的波长读取样品。