눈의 망막 색소 상피층에 영향을 미치는 퇴행성 안구 질환은 단일 유전자 및 다유전자 기원을 가지고 있습니다. 여러 질병 모델과 소프트웨어 응용 프로그램인 LipidUNet이 질병의 메커니즘과 잠재적인 치료 개입을 연구하기 위해 개발되었습니다.
망막 색소 상피(RPE)는 눈 뒤쪽에 위치한 육각형 세포의 단층입니다. 광수용체와 맥락막 모세혈관에 영양과 지원을 제공하고, 광수용체 외분절(POS)의 식균작용을 수행하며, 외망막의 항상성을 유지하기 위해 분극화된 방식으로 사이토카인을 분비합니다. 돌연변이, 노화 및 환경적 요인으로 인한 기능 장애 RPE는 다른 망막층의 퇴행을 초래하고 시력 상실을 유발합니다. 퇴행성 RPE의 특징적인 표현형 특징은 세포 내 및 세포 내 지질이 풍부한 침전물입니다. 이러한 침전물은 다양한 망막 퇴행성 질환에 걸쳐 공통적인 표현형입니다. 시험관 내에서 단일 유전자 망막 변성의 지질 침착 표현형을 재현하기 위해 환자의 섬유아세포에서 유도 만능 줄기 세포 유래 RPE(iRPE)를 생성했습니다. Stargardt 및 후기 발병 망막 변성(L-ORD) 질환 환자에서 생성된 세포주를 7일 동안 POS를 공급하여 RPE 생리 기능을 복제하여 이러한 질병에서 POS 식균 작용 유발 병리를 유발했습니다. 대체 보체 활성화와 관련된 다원성 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)에 대한 모델을 생성하기 위해 iRPE는 대체 보체 아나필라톡신에 도전했습니다. 세포 내 및 세포 내 지질 침전물은 나일 레드, 붕소-디피로메텐(BODIPY) 및 아포지단백 E(APOE)를 사용하여 특성화되었습니다. 지질 침전물의 밀도를 정량화하기 위해 기계 학습 기반 소프트웨어인 LipidUNet이 개발되었습니다. 이 소프트웨어는 배양 표면에서 iRPE의 최대 강도 투영 이미지에 대해 훈련되었습니다. 앞으로는 3차원(3D) 이미지를 분석하고 지질 방울의 부피를 정량화하는 훈련을 받을 예정입니다. LipidUNet 소프트웨어는 질병 모델에서 지질 축적을 감소시키는 약물을 발견하는 데 유용한 리소스가 될 것입니다.
망막 색소 상피(RPE)는 망막 광수용체에 인접한 눈 뒤쪽에 위치한 세포의 단층입니다. RPE는 광수용체에 대사 및 구조적 지원을 제공하여 적절한 시력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 건강한 RPE 세포는 뚜렷한 육각형 형태가 특징입니다. 그것들은 긴밀한 접합부로 연결되어 RPE가 기저부에 위치한 융모막 모세 혈관과 정점에 위치한 광 수용체 사이의 장벽 역할을 할 수 있습니다. 망막 생태계를 유지하기 위해 RPE는 RPE1에서 포도당 소비를 최소화하는 방식으로 포도당과 같은 주요 대사 산물을 광수용체로 셔틀합니다. 이러한 제한으로 인해 RPE는 지방산을 포함한 대사 요구를 유지하기 위해 다른 대사 산물에 의존하며, RPE는 β 산화를 통해 케톤으로 전환됩니다2. 광수용체 외분절(POS) 소화에서 재활용될 가능성이 있는 지방산을 에너지원으로 활용하는 RPE의 성향을 감안할 때, RPE의 지질 처리 경로에 대한 해로운 변화는 종종 단일 유전자 및 다유전자 퇴행성 망막 질환을 유발하거나 연루됩니다3.
RPE 변성을 유발하는 다유전자성 퇴행성 안구 질환인 연령 관련 황반변성(AMD)도 RPE 단층의 비정상적인 자가포식 및 지질 대사와 관련이 있습니다. 기능 장애가 있는 RPE 단층이 POS를 처리하고 다른 중요한 기능을 수행하지 못하면 RPE와 Bruch 막 사이에 위치한 기저 선형 침전물(BLinD)이라고 하는 세포외(하위 RPE) 침전물이 발생하며, 이는 AMD 병리의 특징입니다. BLinD의 주요 성분에는 지단백질이 포함되며, 그 중 가장 풍부한 것은 아포지단백 E(APOE)4입니다. BLinD의 얇은 층이 축적되면 AMD 5,6의 임상 증상으로 인식되는 부드러운 드루젠이 발생할 수 있습니다.
몇몇 그룹은 RPE 기능장애를 유발하는 줄기 세포 유래 시험관내 질환 모델이 서브-RPE 지질 축적을 특징으로 한다는 것을 보여주었다 7,8,9. Hallam et al. (2017)은 CFH 유전자의 다형성으로 인해 AMD 위험이 높은 환자로부터 유도 만능 줄기 세포 유래 RPE(iRPE)를 생성했습니다. iRPE는 APOE에 의해 표시된 바와 같이 드루젠 축적을 보였고, 고위험 RPE는 저위험 환자로부터 생성된 iRPE보다 더 많은 침전물을 축적했다10.
지질 방울 및 드루젠 침착과 같은 AMD의 세포 특징을 요약하는 시험관 내 모델을 만들기 위해 이전에 발표된 발달 유도 프로토콜11을 사용하여 환자 혈액 샘플에서 생성된 iRPE 라인을 설정했습니다. iRPE는 AMD의 가능한 원인 중 하나를 모방하는 아나필라톡신을 함유한 용액인 보체 적격 인간 혈청(CC-HS)에 노출되었다: 증가된 대체 보체 신호 전달8. 지질 침전물의 결과적인 세포 및 세포 내 침착은 일반적으로 사용되는 지질 및 지단백질 마커인 APOE, Nile Red 및 BODIPY를 사용하여 측정되었습니다. 이들 마커를 통해, CC-HS를 통한 활성화된 보체 신호전달이 iRPE 세포에서 지질 축적을 악화시킨다는 것을 보여주었다8.
단일 유전자 망막 퇴행성 질환에 대한 질병 모델을 개발하기 위해 RPE의 ABCA4 유전자 돌연변이로 인해 발생하는 질병인 스타가르트병 환자로부터 iRPE 라인을 개발했습니다. ABCA4 가 녹아웃되면 높은 수준의 인지질과 광 의존성 지질 과산화 생성물을 포함하는 것으로 알려진 세포 내 침전물인 A2E 리포푸신이 RPE12 내부에 축적되는 것으로 나타났습니다. ABCA4 녹아웃 라인은 환자 라인과 함께 개발되었으며 둘 다 POS 공급을 받았습니다. Stargardt iRPE는 BODIPY 염색으로 정량화된 증가된 지질 축적을 나타내는 POS 식균 작용 유발 병리를 입증했습니다. ABCA4 KO iPSC에서 유래한 RPE는 CC-HS 처리를 받았습니다. BODIPY 신호의 정량화는 스타가르트병 모델에서도 지질 처리에 결함이 있는 것으로 나타났다9.
이러한 질병의 유병률과 효과적인 치료법의 필요성을 감안할 때, 위에서 설명한 관련 질병 모델과 함께 잠재적 치료법의 효능을 정량화하기 위한 강력한 방법을 확립할 필요가 있습니다. 객관적이고 자동화되고 표준화된 방식으로 지질 침전물을 정량화하기 위해 머신 러닝 기반 소프트웨어인 LipidUNet이 만들어져 마스크 분석 도구와 함께 사용할 때 일반적인 마커인 Nile Red, BODIPY 및 APOE를 사용하여 지질 침착을 빠르고 효과적으로 식별할 수 있습니다. 그런 다음 이 분석 파이프라인을 사용하여 얻은 요약 통계를 분석하고 그래픽으로 표시하여 치료 조건을 쉽게 비교할 수 있습니다. 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1: 프로토콜 개략도: RPE 세포는 96웰 플레이트에서 성장되고 활성 인간 혈청 또는 정제된 소 외부 세그먼트로 챌린지되어 시험관 내에서 다양한 유형의 망막 변성을 모델링합니다. RPE 세포는 Nile Red, BODIPY 및 APOE를 사용하여 지단백질 침전물을 위해 고정되고 염색됩니다. 컨포칼 현미경은 형광 표지된 지질 입자의 Z 스택을 획득하는 데 사용되며, 이후 2D 최대 강도 투영으로 처리됩니다. 기계 학습 알고리즘은 지단백질 입자를 인식하고 정확하게 분할하도록 훈련되었습니다. 입자 수 및 다양한 형상 메트릭이 포함된 요약 테이블이 생성되며 후속 플로팅 및 통계 분석에 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 퇴행성 안구 질환에 대한 단일 유전자 및 다유전자 체외 질환 모델에서 지질 침착물을 효율적으로 라벨링, 이미지 및 정량화하는 방법을 제공합니다. AI 기반 소프트웨어인 LipidUNet은 세 가지 일반적인 지질 마커인 APOE, Nile Red 및 BODIPY에 적용할 수 있으며, 정량화를 표준화하고 편향되지 않은 빠른 자동 분석 방법을 제공합니다.
LipidUNet의 주요 한계는 AI에 대한 훈련 데이터 세트가 96웰 플레이트에서 배양된 세포의 40배 배율 이미지로 제한되었다는 사실입니다. 훈련 이미지 세트의 결과로, 현재 형태의 LipidUNet은 40x 배율 이미지 분석으로 제한됩니다. 이 소프트웨어는 96웰 플레이트 이외의 다른 배양 표면에서 배양된 세포의 40x 이미지를 분석하는 데 사용할 수 있지만, 소프트웨어에 의한 정확한 임계값을 확인하기 위해 생성된 출력 마스크를 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 분석할 수 있는 샘플/이미지의 범위를 확장하려면 더 많은 이미지 세트(다른 배율)가 필요합니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 지질 마커 단계에서 사용자는 선택한 라벨링 컴파운드(BODIPY, APOE, Nile Red)가 샘플을 효과적으로 라벨링했는지 확인해야 합니다. 성숙한 RPE 세포는 종종 심하게 착색되어 항체 면역염색의 형광 신호를 손상시킬 수 있습니다. 형광 신호가 약하거나 배경 염색이 너무 많으면 LipidUNet은 지질 방울을 정확하게 식별할 수 없습니다. 유사한 이유로, 프로토콜의 자동 이미징 단계를 위해 적절하게 선택된 획득 설정이 사용되어야 한다. 획득한 이미지의 품질이 좋지 않으면 LipidUNet이 이미지를 적절하게 마스킹하는 데 어려움을 겪을 수 있으므로 정량화가 부정확합니다(그림 6A-L). 마지막으로, LipidUNet은 소프트웨어가 작동하기 위한 특정 요구 사항을 가지고 있기 때문에 이미지의 후처리는 중요한 단계입니다.
수동 임계값 지정을 사용하는 지질 분석 워크플로우 또는 Fiji와 같은 소프트웨어에서 자동 임계값 설정을 포함하는 기술과 비교할 때, LipidUNet은 지질 입자 식별 시 작은 오류율로 반영되는 가변 지질 증착을 사용하여 이미지 전반에 걸쳐 편향되지 않고 신뢰할 수 있는 분할을 제공합니다(그림 7). 이 소프트웨어를 사용하면 사용자가 추가 훈련 이미지를 입력할 수 있으므로 프로토콜에 설명된 대로 40배 배율 대물렌즈를 사용하는 이미지 세트 또는 다른 지질 마커를 사용하는 이미지 세트를 넘어 분석할 수 있습니다. 앞으로 이 소프트웨어는 지질 침전물의 정량화가 가능하도록 3D 이미지를 분석하도록 훈련될 것입니다. 병리학의 주요 원인으로 지질 침착을 수반하는 퇴행성 안질환이 만연하고 있으며, 노인 인구가 증가함에 따라 사례가 증가할 것으로 예상된다13. 이 프로토콜에 설명된 대로 정확한 질병 모델과 효율적인 분석 도구를 사용하면 새로운 치료 개입을 개발할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
Zeiss 컨포칼 시스템을 사용해 주신 NEI(National Eye Institute) 조직학 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 NEI IRP 기금(보조금 번호 ZIA EY000533-04)의 지원을 받았습니다.
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |