果肉をふるいにかけて畑で未熟なテフリチドショウジョウバエを検出する

野外で収集された果物からの初期および後期 のアナストレファサスペンサ 抽出この実験では、検出された幼虫の割合とそれらを検出するのに必要な平均時間に関して、果肉の切断とマッシュ、ふるい分け、および浮遊(MSF)法を比較しました。 アナストレファ・サスペンサの幼虫が大量に蔓延しているグアバは、フロリダ大学、食品農業科学研究所、熱帯研究教育センター、フロリダ州ホームステッドにある植物から収集されました。果実を無作為に5群に分類し,1)手切り法または2)MSF法の2つの幼虫抽出法のうちの1つに割り付けた。各抽出方法を用いて肉眼で見える全ての幼虫を採取する時間を記録した。 手切り法は、根絶プログラムで現在使用されている方法に従った。5人の労働者(n = 5)のそれぞれに5つの果物が割り当てられ、果物を細かく切り、果肉を視覚的に検査することにより、幼虫のすべての段階を検索しました。目視検査で幼虫が見逃されたかどうかを判断するために、手でカットされた果物片を解剖顕微鏡(10x)を使用して再検査しました。 MSF法では、5つの果物を大きな断片(50〜80 cm)にカットし、ジップロックバッグに入れ、すべての果肉が皮から剥がれ、果肉が滑らかな粘稠度になるまで(つまり、大きな塊がなくなるまで)手で軽く絞りました。マッシュアップされた果実は、一連の大きな(45.7 cm)真ちゅう製のふるいを通して濾されました。最大のメッシュ(8番)が上部に積み重ねられ、次に20番と45番のメッシュふるいが続きました。この処理に割り当てられたスタッフは、シンクの蛇口に接続されたホースからの水を使用して、メッシュを通してパルプを洗浄しました。晩齢幼虫はふるいに見えた。小さいインスターは果肉と混合されていたため、見たり取り出したりするのが困難でした。したがって、ふるいからのパルプ/幼虫混合物は、1Lの黒糖水溶液とともにバケツに入れられました。幼虫はすぐに水面に浮かんだ。溶液を穏やかに撹拌し、そして5分後、幼虫をバケツから取り出しそして計数した。果実を処理する時間は、マッシュアップ、ふるい分け、および砂糖水溶液からの幼虫の除去の組み合わせでした。手作業による切断法またはふるい分け法および浮遊法で見つかった幼虫の数に関するデータは、Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定(p = 0.05)16を使用して分析されました。 MSF法は、手作業で切断するよりも多くの幼虫(図2A)と1分あたりの幼虫数(図2B)を多く生成しました。この研究では、異なる齢の検出は定量化されていませんが、すべての齢(1齢、2齢、3齢)がふるいを使用して見つかったのに対し、後の齢(2齢と3齢)のみが手作業で切断されたことがわかりました。以前に切断され目視検査されたサンプルを解剖顕微鏡スコープで再検査したところ、果実に寄生している晩齢幼虫の40%が見逃されました。しかし、以前の齢は主に再検査で発見されました。 この実験は、MSF法を使用することが、非常に感染している果物の幼虫を見つけるのにより効果的かつ効率的であることを示しました。ただし、幼虫の数が少ない果物は、侵入種が非常にまれな根絶プログラムで遭遇する可能性が高くなります。したがって、我々は、宿主果実に既知の、少数の幼虫が蔓延している実験室研究を実施した。 低 バクトセラ背 蔓延をシミュレートするためのマンゴーとパパイヤの手動蔓延この実験では、検出された幼虫の割合と、蔓延が比較的少ない場合にそれらを検出するのに必要な時間に関して、果物の切断方法とMSF法を比較しました。手動侵入は、存在する幼虫の数が確実にわかっているため、各方法の有効性を評価するための実験ツールとして使用されました。 コルクボーラー(直径1.0 cm)を使用して、ショウジョウバエの幼虫のない個々のマンゴーとパパイヤの果実に5つの穴を開けました。1匹の2齢後半から3齢前半の B. dorsalis幼虫 を、果実のサブセットの5つの穴のそれぞれに配置しました。穴は果物から穴を開けた部分を使用してキャップされ、残りの果物は幼虫を挿入せずにキャップされ、手動の侵入を視覚的にシミュレートしました。果実を27°Cで48時間保持し,幼虫の発育を可能にした。実験は、ハワイ島ヒロのARS研究所(n = 5人の労働者)とハワイのオアフ島のAPHIS-PPQ研究所(n = 4人の労働者)で実施されました。 果物の切断のために、各労働者は5つのマンゴー(1匹は1匹の幼虫が蔓延し、4匹は蔓延していない)と4匹のパパイヤ(1匹は蔓延し、3頭は蔓延していない)を与えられました。労働者は各果物を個別に細かく切り、未熟なショウジョウバエがないか果肉を継続的に検査しました。パルプが徹底的に検査されたとき、検索は中止されました。見つかった幼虫の総数と、各労働者がすべての果物を切断して処理するために費やした時間を記録しました(図3)および(図4)。 各労働者は、マッシュまたはふるい分け(果物の切断を含まない)のために別の同様の果物のセット(5つのマンゴーと4つのパパイヤ)を受け取り、前述のように2個が蔓延しました。パルプを最上部の篩に注ぎ、蛇口からの水を使用して篩のスタックを通して洗浄し、プロトコルに記載されているように幼虫を除去した。実験は、浮遊ステップを取り除くことで感度を失うことなくプロセスの速度が向上するかどうかを決定するために、砂糖浮遊ありと砂糖浮遊なしの2回実施されました(つまり、すべてまたはほとんどの幼虫が見つかりました)(図3)。見つかった幼虫の数と、各労働者が切断、MSF、またはMS法で果物を処理するために費やした時間を記録しました。 マンゴーとパパイヤの両方で、完全なMSF法(浮遊を含む)は、幼虫の検出数が多く、果物の切断よりも速かった(表1)。伝統的な果物の切断方法を使用している労働者は、マンゴーとパパイヤに置かれた幼虫のそれぞれ32%と35%を逃しました(表1)。MSF技術を使用して果物をまとめて処理するには、個々のマンゴーをカットするよりも30%短い時間で済み、個々のパパイヤをカットするよりも35%短い時間が必要でした(図3)。MSF法では、パパイヤ(図3C)とマンゴー(図3D)を果実切断法と比較して、毎分より多くの幼虫が見つかりました。見つかったすべての幼虫は生きていました。 幼虫の形態学的同定は、後期の齢でのみ可能です。上記の実験を繰り返したが,浮遊手順を省略し,幼虫の回復率が高く,果実処理速度が速くなるかどうかを調べた。MS法(浮遊を省略)は、切断および目視検査と比較して、パパイヤ(図4A)およびマンゴー(図4B)の幼虫検出数が多くなりました。さらに、この技術は、パパイヤ(図4C)とマンゴー(図4D)をカットして目視検査するよりも高速でした。MSF法から浮遊ステップを取り除くと、晩齢幼虫を見つける時間がパパイヤで90%、マンゴーで48%短縮されました(表2)。見つかった幼虫の割合は両方の方法で高く、MSで一貫して高かった(浮遊は省略)。パパイヤについては、幼虫の80%および85%がそれぞれMSFおよびMS法から回収された(表1 および 表2)。マンゴーについては、それぞれ88%および95%がMSFおよびMS法から回収された(表1 および 表2)。 果樹法とMSF法の圃場比較この実験の目的は、緊急ショウジョウバエプログラムを模倣して、野外条件下での果実切断法とMSF法を比較することでした。果実処理は、2つの幼虫抽出方法の圃場準備をテストするために、実験室の利便性とインフラストラクチャなしで実施されました。作業は、ヒロ近郊のUSDA-ARS熱帯植物遺伝資源および疾患研究ユニットGermplasmにあるグアバ果樹園で行われました。蔓延の兆候を示す合計40のグアバを収集し、2つのグループに分けました。合計20個のグアバを切断/目視検査した後、MSF(浮上を含む)を行い、MSF法と比較した切断方法の感度を評価することができました。解剖は上記のように進行した。検出されたとき、幼虫は取り除かれ、数えられました。4人の労働者がそれぞれ5グアバを解剖し、切断と検査に要した時間を各労働者について記録した。MSFの切断後を上記と同様に行ったが、8番篩と20番篩に加えて3番目の小目篩(No.40、0.420 mm)を使用して小さな幼虫を回収した。20個のグアバの2番目のセットを2つのジップロックバッグ(バッグあたり10個の果物)に入れ、MSFのみ(つまり、切断なし)にかけ、果物の切断に必要な時間とMSFを比較できました。上記のように、この手順では3つのふるいを使用した。見つかった幼虫の数と果物を処理する合計時間(果実を袋に入れて5分間マッシュアップ/ふるい分け/砂糖溶液に浮かべる)が記録されました。 実験室で見つかったように、果物の切断は果物の蔓延を過小評価し、非常に変動し、MSF法を使用して回収できるものよりも25%〜83%少ない幼虫を検出しました(表3)。さらに、幼虫の数が少ないサンプルでは、MSFは500%多くの幼虫を回収し、より高いアッセイ感度を提供し、寄生生物を特定する可能性が高くなりました。果物は、切断と比較してMSF法を使用してはるかに高速に処理されました。5個の果物をカットして検査するには、MSF で 10個の果物を処理するのとほぼ同じ時間が必要でした。 図1:ショウジョウバエ幼虫抽出プロトコルの手順。 (A)一度に約2容量Lの果物を処理します(たとえば、5つのグアバまたは5つの中型マンゴーがこの方法の適切なサンプルを構成します)。(B)果物を大きく切り、4Lのジップロック収納バッグに入れます。(C)刻んだ果物を25〜50 mm覆うまで袋に水を加えます。 (D)すべての果肉が皮から外れ、滑らかな粘稠度になるまで(つまり、大きな塊がなくなるまで)、果物を手でそっと絞ります。(E)大きなメッシュ(No.8;2.36 mm)のふるいを上に置き、続いて小さなメッシュ(No.20;0.85 mm)のふるいを重ねます。初期の齢の場合は、スタックの下部に3番目のふるい(No.45;0.35 mm)を置きます。(F)パルプを一番上のふるいに注ぎます。(G)細かいパルプが最初のふるいを通過するまで、蛇口、ホース、またはボトルからの水を使用して、ふるいの積み重ねを通してパルプを完全に洗浄します。(H)上部のふるいを視覚的にスキャンして、皮や大きな果物片と一緒に保持されている可能性のある晩年の幼虫を探します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:野外で採集された果実からの初期および後期のアナストレファサスペンサ抽出。5つのグアバ果実から採取したアナストレファ・サスペンサ幼虫の平均数±(平均[SE]の標準誤差)を、切断して目視検査(切断:70.4±11.9)または果肉を一連の3つの篩で洗浄した後、果肉を糖水溶液に浸した(MSF:175.6±21.91)(A)。切断(1.21 ± 0.16)およびMSF(3.71 ± 0.50)によって処理された5グアバから毎分収集された幼虫の平均数(±SE)(B)。各方法は5回再現され、バーの上のアスタリスクは、クラスカル-ウォリス検定に基づく幼虫の数(χ2 = 6.81、p < 0.01)と処理時間(χ2 = 6.80、p < 0.01)の有意差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:マンゴーとパパイヤの手動蔓延を使用した完全なマッシュふるい浮上法の検証 バクトセラ背部への低蔓延をシミュレートします。パパイヤ(伐採:3.25 ± 0.51, MSF: 4.0 ± 0.4)(A)およびマンゴー(刈り取り:3.4 ± 0.51, MSF: 4.4 ± 0.4)の果実と1分間に採取された幼虫数(±SE)の平均数(±±C)およびマンゴー(切断:0.14 ± 0.01, MSF: 0.21 ± 0.03)(D)±).切断法またはMSF法(浮遊を含む、n = 5)を使用して処理された果実には、5匹の3齢幼虫が手作業で寄生しました。バーの上のアスタリスクは、クラスカル-ウォリス検定に基づく果物の切断と比較した場合、パパイヤ(χ2 = 5.39、p = 0.02)およびマンゴー(χ2 = 3.94、p = 0.05)で見つかった幼虫の数の有意差を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:マンゴーとパパイヤの手動蔓延を使用したマッシュふるい分け法(浮遊除去)の検証 バクトセラ背部への低蔓延をシミュレートします。 パパイヤ(切断:0.25 ± 0.48, MS: 4.25 ± 0.48)(A)とマンゴー(切断:2.5 ± 0.5, MS:4.75 ± 0.25)(B)の果実と1分間に採取された幼虫数(±SE)は、パパイヤ(切断:0.15 ± 0.05, MS: 0.76 ± 0.15)(C)とマンゴー(切断:0.16 ± 0.04, MS:0.44 ± 0.04)(D)の果実と1分間に平均収集された幼虫数(SE)です。±果実に手作業で5匹の3齢のBactrocera dorsalis幼虫を寄生させ、切断して目視検査(切断)して処理するか、袋に入れて篩で洗い流しました(ムッシングとふるい分けのみ、浮遊なし、n = 4)。バーの上のアスタリスクは、パパイヤ(χ2 = 5.46、p = 0.02)とマンゴー(χ2 = 5.25、p = 0.02)で見つかった幼虫の数と、パパイヤ(χ2 = 5.39、p = 0.02)とマンゴー(χ2 = 5.39、p =0.02)の処理時間について、クラスカル-ウォリス検定に基づいて、果物の切断と比較した有意差を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 果物 # 加工フルーツ #Larvae が追加されました 処理方法 #Larvae 見つかりました 処理時間 (分)* % 回収率 マンゴー 25 25 切断 17 158 68% マンゴー 25 25 ティッカー 22 113 88% パパイヤ 16 20 切断 13 62 65% パパイヤ 16 20 ティッカー 16 40 80% *合計時間は5人以上の労働者を合計しました。 表1:切断および目視検査(切断)または完全マッシュ、ふるい分け、および浮遊(MSF)法による果実の回収数と処理時間。 試験果実には、退屈して蓋をした果実のみを混合した5匹の3齢幼虫(5つのマンゴーのうち1つ、4つのパパイヤのうち1つ)を手動で寄生させた。 果物 # 加工フルーツ #Larvae が追加されました 処理方法 #Larvae 見つかりました 処理時間 (分)* % 回収率 マンゴー 20 20 切断 10 66 50% マンゴー 20 20 さん 19 44 95% パパイヤ 16 20 切断 5 38 25% パパイヤ 16 20 さん 17 25 85% *合計時間は4人以上の労働者を合計しました。 表2:回収された幼虫の数と、切断またはマッシュアンドふるい分けのみによって果実を処理する時間、浮遊は省略(MS)。 試験果実には、退屈して蓋をした果実のみを混合した5匹の3齢幼虫(マンゴーの5個に1個、パパイヤの4個に1個)を手動で寄生させた。 作業者/メソッド 処理 #Fruit 処理時間 (分) #Larvae 切断が見つかりました #Larvae MSF * を見つけました。 切断によって見つかった総数の幼虫の割合 作業者1:切断 5 18 33 14 70% 作業者2:切断 5 18 1 5 17% 作業者3:切断 5 26 9 11** 75% 作業者4:切断 5 20 24 ワーカー 5: MSF 10 22 該当なし 22 該当なし ワーカー 6: MSF 10 18 該当なし 37 該当なし *切断および目視検査からのパルプをMSF法を使用して再度処理し、見逃された後期2〜3齢 幼虫の数を決定しました ** MSF法による加工前にプールされた労働者2および3の果実の果肉 表3:果実を切断して目視検査(切断)するか、果実をマッシュアップ、ふるい分け、浮遊(MSF)することによって、野外で収集されたグアバで見つかった幼虫の数。