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Biologia

Setacciare la polpa della frutta per rilevare moscerini della frutta tefritidi immaturi sul campo

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
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1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

Aumentare il rilevamento di moscerini della frutta tefritidi immaturi sul campo può innescare sforzi tempestivi per eliminare le popolazioni di questi parassiti distruttivi. Rilevare le larve tardive è più veloce e più preciso quando si mushing frutta ospite in un sacchetto e si passa la polpa attraverso una serie di setacci rispetto al taglio manuale e all’ispezione visiva.

Abstract

I moscerini della frutta della famiglia Tephritidae sono tra i parassiti agricoli più distruttivi e invasivi del mondo. Molti paesi intraprendono costosi programmi di eradicazione per eliminare le popolazioni incipienti. Durante i programmi di eradicazione, viene fatto uno sforzo concertato per rilevare le larve, poiché ciò indica fortemente una popolazione riproduttiva e aiuta a stabilire l’estensione spaziale dell’infestazione. Il rilevamento di fasi di vita immature innesca ulteriori azioni di controllo e regolamentazione per contenere e prevenire qualsiasi ulteriore diffusione del parassita. Tradizionalmente, il rilevamento larvale viene effettuato tagliando i singoli frutti dell’ospite ed esaminandoli visivamente. Questo metodo è laborioso, poiché è possibile elaborare solo un numero limitato di frutta e la probabilità di perdere una larva è alta. È stata testata una tecnica di estrazione che combina i) mushing frutta ospite in un sacchetto di plastica, ii) filtrare la polpa attraverso una serie di setacci, iii) mettere la polpa trattenuta in una soluzione di acqua zuccherata marrone e iv) raccogliere le larve che galleggiano in superficie. Il metodo è stato valutato in Florida con guava raccolta sul campo infestata naturalmente da Anastrepha suspensa. Per imitare le popolazioni basse più rappresentative di un programma di eradicazione della mosca della frutta, mango e papaia nelle Hawaii sono stati infestati da un noto basso numero di larve di Bactrocera dorsalis . L’applicabilità del metodo è stata testata sul campo su guava naturalmente infestata da B. dorsalis per valutare il metodo nelle condizioni sperimentate dai lavoratori durante un programma di emergenza di mosca della frutta. Sia nelle prove sul campo che in laboratorio, l’ammucchiatura e la setacciatura della polpa erano più efficienti (richiedevano meno tempo) e più sensibili (più larve trovate) rispetto al taglio della frutta. Far galleggiare la polpa in una soluzione di acqua di canna zuccherata ha aiutato a rilevare le prime larve instar. Mushing e setacciare la polpa di frutta di importanti ospiti tefritidi può aumentare la probabilità di rilevare larve durante i programmi di emergenza.

Introduction

I moscerini della frutta tefritidi sono tra i parassiti agricoli più distruttivi, con i generi Anastrepha, Bactrocera e Ceratitis che rappresentano il maggior rischio1. Molte aree sono ad alto rischio per l’insediamento di moscerini della frutta esotica, sulla base di 1) incursioni storiche e programmi di delimitazione ed eradicazione associati, 2) l’alto tasso di arrivo di materiale ospite di mosca della frutta nei porti di ingresso e 3) condizioni climatiche favorevoli per l’insediamento di popolazioni riproduttive. Lo stato della California sperimenta molteplici incursioni e rilevamenti di tefritidi ogni anno2. Ci sono state più di 200 incursioni e programmi di eradicazione contro i tefritidi a livello globale nel corso dell’ultimo secolo, e questo ha accelerato significativamente negli ultimi decenni3. Sebbene la stragrande maggioranza di questi programmi riesca a sradicare la mosca della frutta invasore3,4, l’onere economico e ambientale di queste invasioni rimane ancora elevato e la possibilità di stabilirsi è sempre presente; un recente esempio catastrofico è l’infezione di Bactrocera dorsalis nel continente africano5.

Durante i programmi di emergenza per la mosca della frutta, viene fatto uno sforzo concertato per rilevare e controllare le popolazioni riproduttive delle specie invasori. Ad esempio, lo stato della Florida risponde alle incursioni tefritidi applicando inzuppamenti del suolo (sotto la linea di gocciolamento di piante ospiti fruttifere) e rimuovendo i frutti ospiti in un raggio di 200 m intorno ai siti in cui si trovano femmine accoppiate e / o larve6. Queste azioni e tattiche servono a uccidere larve e pupe nel terreno e rimuovere eventuali uova e larve dai frutti all’interno dell’area. In alcuni programmi di eradicazione, viene rimossa una quantità significativa di frutta ospite. Nel 2015, oltre 100.000 kg di frutta sono stati distrutti durante il programma di eradicazione di B. dorsalis in Florida6. Le perdite economiche per i coltivatori e le industrie associate nella sola area in quarantena sono state stimate in oltre $ 10,7 milioni7.

Per trovare larve di tefritidi nelle aree di quarantena, un piccolo team di entomologi raccoglie i frutti ospiti in un raggio di 200 m attorno a un’area di rilevamento delle mosche femmine e taglia e ispeziona visivamente ogni frutto per le larve6. Con risorse di personale limitate e centinaia di possibili ospiti, il compito diventa difficile, in particolare nelle aree in cui la diversità degli impianti sia nelle aree di produzione commerciale che nei cantieri residenziali è elevata. Inoltre, le larve possono mancare quando si tagliano i frutti ospiti. In uno studio che ha valutato il taglio della frutta nei porti di entrata, il taglio della frutta non è risultato altrettanto efficace nel rilevare A. suspensa rispetto a tenere i frutti infestati per diverse settimane e contare le larve e le pupe trovate nel substrato di pupa8.

Esistono alternative al taglio della frutta per rilevare un’infestazione 9,10,11,12,13. Ad esempio, una galleggiazione dello zucchero di canna e un metodo di acqua calda sono entrambe procedure accettate utilizzate per rilevare i moscerini della frutta delle ciliegie occidentali nelle ciliegie raccolte 9,10. Il metodo dello zucchero di canna prevede il posizionamento di frutta schiacciata in soluzione di acqua zuccherata e la raccolta delle larve che galleggiano verso l’alto. Il metodo di galleggiamento dello zucchero di canna è stato sviluppato specificamente per soddisfare le norme normative per le ciliegie esportate, che richiedono ai centri di imballaggio di monitorare i parassiti della mosca della frutta in quarantena. Esiste anche un programma di certificazione dei mirtilli USA-Canada approvato che include la galleggiazione dell’acqua di zucchero di canna, la galleggiazione dell’acqua salata o l’ebollizione per supportare la fitosanizzazione14. Durante il test dell’accuratezza della galleggiazione dello zucchero e dell’acqua calda, i ricercatori hanno utilizzato il metodo di setacciatura per determinare quante larve sono perse 9,10,11,12,13. Uno studio ha dimostrato che mescolare mirtilli tritati in una soluzione salina e filtrare la soluzione attraverso un filtro da caffè riutilizzabile era quattro volte migliore nel rilevare le larve di Drosophila suzukii rispetto all’ispezione visiva della superficie delle soluzioni di sale e zucchero14. Inoltre, la gascromatografia è stata utilizzata per la rilevazione di larve di A. suspensa negli agrumi15. Questi approcci non sono stati testati per l’applicabilità nelle indagini sul campo.

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare e testare un metodo per trovare larve di tefritidi sul campo utilizzando setacciatura e galleggiamento dell’acqua zuccherata. Questo metodo consente il rilevamento più efficiente dei moscerini della frutta immaturi rispetto al tradizionale metodo di taglio della frutta, supportando il controllo tempestivo delle popolazioni riproduttive durante i programmi di eradicazione della mosca della frutta.

Protocol

1. Selezione di frutta Determina quale frutta è disponibile nell’area da esaminare. Selezionare il frutto ospite in base all’elenco degli ospiti noti per le specie tefritidi target. Scegli frutta matura a polpa morbida, come mango, papaia e guava. I frutti acerbi o a polpa dura, come le mandorle tropicali, dovrebbero essere ispezionati con un metodo diverso, come il taglio della frutta. Seleziona frutta caduta, troppo matura o frutta matura su alberi che hanno segni di danni, cicatrici da ovideposizione e punti deboli. Elaborare circa 2 litri di frutta in una sola volta (ad esempio, 5 guaiave o 5 mango di medie dimensioni costituiscono campioni adeguati per questo metodo). Il numero di frutti che possono essere lavorati contemporaneamente dipende dalla dimensione dei frutti (Figura 1A). 2. Mushing Tagliare il frutto in pezzi grandi e metterlo in un sacchetto da 4 litri con chiusura a zip (Figura 1B). Aggiungere acqua al sacchetto fino a quando l’acqua copre il frutto tritato di 25-50 mm (Figura 1C). Spremere delicatamente il frutto a mano fino a quando tutta la polpa si è staccata dalla buccia e ha una consistenza liscia (cioè senza grossi pezzi) (Figura 1D). 3. Setacciatura per la raccolta tardiva Impilare i setacci. Utilizzare setacci grandi (diametro 457 mm) per la lavorazione di grandi quantità di frutta (~ 5 frutti contemporaneamente) e setacci più piccoli (diametro 305 mm) per singoli frutti o campioni più piccoli (< 5 frutti). Impilare il setaccio con un setaccio a maglie larghe (n. 8; 2,36 mm) sopra un setaccio a maglie piccole (n. 20; 0,85 mm). Per il rilevamento delle prime stelle, posizionare un terzo setaccio (n. 45; 0,35 mm) sul fondo della pila (Figura 1E). Versare la polpa nel setaccio superiore (Figura 1F). Lavare accuratamente la polpa attraverso la pila di setacci usando acqua da un rubinetto, un tubo flessibile o una bottiglia fino a quando la polpa fine non è passata attraverso i setacci (Figura 1G). Scansionare visivamente i setacci superiori alla ricerca di larve tardive che potrebbero essere state trattenute con la buccia o qualsiasi grande pezzo di frutta (Figura 1H). Ispezionare attentamente il secondo setaccio per le larve tardive. Con grandi quantità di polpa fine, potrebbe essere necessario un ulteriore risciacquo. Raccogliere le larve dai setacci con pinze larvali e metterle in fiale con il 70% di EtOH. 4. Fluttuazione dello zucchero per la raccolta anticipata Premiscelare la soluzione zuccherina sciogliendo 453 g (1 scatola) di zucchero di canna scuro in 2 L di acqua di rubinetto, che produce una lettura Brix di 19°10. Lavare la polpa dai setacci a maglie più fini (ad esempio, n. 20 e n. 45) fino al bordo del setaccio con acqua di rubinetto, quindi spostare il materiale in una padella di plastica (11 L). Aggiungere la soluzione di zucchero di canna fino a coprire la polpa di 25-50 mm e aggiungere 2 gocce di antischiuma. Lasciare riposare la polpa nella soluzione di zucchero di canna per circa 5 minuti. Raccogliere le larve che galleggiano sulla superficie della soluzione con pinze larvali in flaconcini con il 70% di EtOH. 5. Cura larvale Etichettare una fiala con il luogo di raccolta, la data, il tipo di frutta e il raccoglitore per un successivo esame e identificazione.

Representative Results

Estrazione precoce e tardiva di Anastrepha suspensa dalla frutta raccolta in campoIn questo esperimento, abbiamo confrontato i metodi di taglio della frutta e di mushing, setacciatura e galleggiamento (MSF) rispetto alla proporzione di larve rilevate e al tempo medio necessario per rilevarle. La guava, altamente infestata dalle larve di Anastrepha suspensa, è stata raccolta da una pianta situata presso l’Università della Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. I frutti sono stati ordinati casualmente in gruppi di 5 e assegnati a 1 dei 2 metodi di estrazione larvale: 1) taglio a mano o 2) metodo MSF. È stato registrato il tempo per raccogliere tutte le larve visibili ad occhio nudo utilizzando ciascun metodo di estrazione. Il metodo di taglio a mano ha seguito il metodo attualmente utilizzato in un programma di eradicazione. A ciascuno dei 5 operai (n = 5) sono stati assegnati 5 frutti per cercare tutte le fasi delle larve tagliando i frutti in pezzi più piccoli e ispezionando visivamente la polpa. Per determinare se le larve sono state perse nell’ispezione visiva, i pezzi di frutta tagliati a mano sono stati nuovamente ispezionati utilizzando un microscopio da dissezione (10x). Per il metodo MSF, 5 frutti sono stati tagliati in pezzi grandi (50-80 cm), posti in sacchetti con chiusura a zip e spremuti delicatamente a mano fino a quando tutta la polpa è stata staccata dalla buccia e la polpa ha avuto una consistenza liscia (cioè senza grossi pezzi). Il frutto mushed è stato filtrato attraverso una serie di grandi setacci di ottone (45,7 cm). La maglia più grande (n. 8) è stata impilata sulla parte superiore, seguita da un numero n. 20 e un setaccio a maglia n. 45. Il personale addetto a questo trattamento lavava la polpa attraverso la rete usando l’acqua di un tubo collegato a un rubinetto del lavandino. Le larve tardive erano evidenti nei setacci. Le stelle più piccole erano mescolate con polpa, rendendole difficili da vedere e rimuovere. Pertanto, la miscela di polpa / larve dai setacci è stata messa in secchi con 1 L di soluzione di acqua zuccherata di canna. Le larve galleggiarono immediatamente in superficie. La soluzione è stata delicatamente agitata e, dopo 5 minuti, le larve sono state rimosse dai secchi e contate. Il tempo per elaborare il frutto era una combinazione di mushing, setacciatura e rimozione delle larve dalla soluzione di acqua zuccherata. I dati relativi al numero di larve trovate attraverso i metodi di taglio manuale o setacciatura e galleggiamento sono stati analizzati utilizzando il test non parametrico Kruskal-Wallis (p = 0,05)16. Il metodo MSF ha prodotto un numero maggiore di larve (Figura 2A) e più larve al minuto (Figura 2B) rispetto al taglio manuale. Sebbene il rilevamento delle diverse stelle non sia stato quantificato in questo studio, abbiamo osservato che tutte le stelle (prima, seconda e terza) sono state trovate usando i crivelli, mentre solo le stelle successive (seconda e terza) sono state viste usando il taglio a mano. Quando i campioni precedentemente tagliati e ispezionati visivamente sono stati nuovamente ispezionati con un microscopio da dissezione, il 40% delle larve tardive che infestano i frutti sono state perse. Tuttavia, le stelle precedenti sono state trovate principalmente con la nuova ispezione. Questo esperimento ha dimostrato che l’uso del metodo MSF è più efficace ed efficiente per trovare larve in frutti altamente infestati. Tuttavia, i frutti infestati da un numero inferiore di larve sono più probabili incontrati in un programma di eradicazione, dove le specie invasori sarebbero molto rare. Pertanto, abbiamo condotto uno studio di laboratorio in cui il frutto ospite era infestato da un numero noto e basso di larve. Infestazione manuale di mango e papaia per simulare l’infestazione da bassa Bactrocera dorsalisQuesto esperimento ha confrontato i metodi di taglio dei frutti e MSF rispetto alla percentuale di larve rilevate e al tempo necessario per rilevarle quando l’infestazione era relativamente bassa. L’infestazione manuale è stata utilizzata come strumento sperimentale per valutare l’efficacia di ciascun metodo, poiché il numero di larve presenti era noto con certezza. Una piralide del sughero (1,0 cm di diametro) è stata utilizzata per fare 5 fori nei singoli frutti di mango e papaia privi di larve di moscerino della frutta. Una singola larva di B. dorsalis è stata collocata in ciascuno dei 5 fori di un sottoinsieme del frutto. I fori sono stati tappati utilizzando il pezzo forato dal frutto e il frutto rimanente è stato tappato senza inserire larve per simulare visivamente l’infestazione manuale. I frutti sono stati tenuti a 27 °C per 48 ore per consentire lo sviluppo larvale. L’esperimento è stato condotto presso il laboratorio ARS di Hilo, Hawaii Island (n = 5 lavoratori) e il laboratorio APHIS-PPQ sull’isola di Oahu, Hawaii (n = 4 lavoratori). Per il taglio della frutta, ad ogni operaio venivano dati 5 mango (1 infestato da 1 larva e 4 non infestati) e 4 papaie (uno infestato e 3 non infestati). Un operaio tagliava ogni frutto individualmente in pezzi sempre più piccoli e ispezionava continuamente la polpa per eventuali moscerini della frutta immaturi. La ricerca è stata interrotta quando la polpa è stata accuratamente ispezionata. Sono stati registrati il numero totale di larve trovate e il tempo impiegato da ciascun lavoratore per trattare tutti i frutti mediante taglio (Figura 3) e (Figura 4). Ogni lavoratore ha ricevuto un altro set simile di frutti (5 mango e 4 papaie) per mushing o setacciatura (senza tagliare la frutta coinvolto), con 2 pezzi infestati come descritto in precedenza. La polpa è stata versata nel setaccio superiore e lavata attraverso la pila di setacci usando acqua da un rubinetto e larve rimosse, come descritto nel protocollo. L’esperimento è stato condotto due volte, con la fluttuazione dello zucchero e senza galleggiamento dello zucchero, per determinare se la rimozione della fase di galleggiamento avrebbe aumentato la velocità del processo senza perdere sensibilità (cioè, tutte o la maggior parte delle larve sono state trovate) (Figura 3). Sono stati registrati il numero di larve trovate e il tempo impiegato da ciascun lavoratore per elaborare il frutto attraverso il metodo di taglio, MSF o MS. Sia per i mango che per le papaie, il metodo MSF completo (flottante incluso) ha portato a un numero maggiore di rilevamenti larvali ed è stato più veloce del taglio dei frutti (Tabella 1). I lavoratori che utilizzano il metodo tradizionale di taglio della frutta hanno perso il 32% e il 35% delle larve collocate rispettivamente nel mango e nella papaia (Tabella 1). La lavorazione dei frutti alla rinfusa con la tecnica MSF ha richiesto il 30% di tempo in meno rispetto al taglio dei singoli mango e il 35% in meno rispetto al taglio delle singole papaie (Figura 3). Sono state trovate più larve al minuto usando il metodo MSF per la papaia (Figura 3C) e il mango (Figura 3D) rispetto al metodo di taglio della frutta. Tutte le larve trovate erano vive. L’identificazione morfologica larvale è possibile solo per gli stadi tardivi. Abbiamo ripetuto l’esperimento di cui sopra, ma abbiamo omesso la procedura di galleggiamento per determinare se il recupero delle larve rimaneva elevato e la velocità di lavorazione della frutta aumentava. Il metodo MS (con galleggiamento omesso) ha portato a più rilevamenti larvali per papaia (Figura 4A) e mango (Figura 4B) rispetto al taglio e all’ispezione visiva. Inoltre, la tecnica era più veloce del taglio e dell’ispezione visiva della papaia (Figura 4C) e del mango (Figura 4D). La rimozione della fase di galleggiamento dal metodo MSF ha ridotto il tempo necessario per trovare larve tardive del 90% per la papaia e del 48% per i mango (Tabella 2). La percentuale di larve trovate era elevata per entrambi i metodi ed era costantemente più alta per la SM (galleggiamento omesso). Per la papaia, l’80% e l’85% delle larve sono state recuperate rispettivamente dai metodi MSF e MS (Tabella 1 e Tabella 2). Per il mango, l’88% e il 95% sono stati recuperati rispettivamente dai metodi MSF e MS (Tabella 1 e Tabella 2). Confronto sul campo dei metodi di taglio della frutta e MSFL’obiettivo di questo esperimento era confrontare il taglio della frutta e i metodi MSF in condizioni di campo, imitando un programma di emergenza per la mosca della frutta. La lavorazione della frutta è stata condotta senza la convenienza e l’infrastruttura del laboratorio per testare la prontezza sul campo dei due metodi di estrazione larvale. Il lavoro è stato condotto in un frutteto di guava situato presso l’USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm vicino a Hilo. Un totale di 40 guaiave che mostravano segni di infestazione sono state raccolte e divise in 2 gruppi. Un totale di 20 guaiave sono state sottoposte a ispezione visiva seguita da MSF (flottante inclusa), che ha permesso di valutare la sensibilità del metodo di taglio rispetto al metodo MSF. La dissezione procedette come descritto sopra. Quando sono state rilevate, le larve sono state rimosse e contate. Quattro operai hanno sezionato 5 guaiave ciascuno, e il tempo necessario per il taglio e l’ispezione è stato registrato per ogni lavoratore. Il post-taglio MSF è stato condotto come sopra, tranne per il fatto che è stato utilizzato un terzo setaccio a maglie più piccole (n. 40, 0,420 mm) in aggiunta ai setacci n. 8 e n. 20 per raccogliere le larve più piccole. La seconda serie di 20 guaiave è stata collocata in 2 sacchetti con chiusura a zip (10 frutti per sacchetto) ed è stata sottoposta solo a MSF (cioè senza taglio), il che ha permesso un confronto tra il tempo necessario per il taglio della frutta e MSF. Come sopra, in questa procedura sono stati utilizzati tre setacci. Sono stati registrati il numero di larve trovate e il tempo totale per trattare la frutta (mushing e tenere il frutto per 5 minuti nel sacchetto / setacciatura / galleggiamento in soluzione zuccherina). Come scoperto in laboratorio, il taglio della frutta ha sottostimato l’infestazione da frutta ed è stato altamente variabile, rilevando il 25% -83% in meno di larve rispetto a quelle che potrebbero essere recuperate utilizzando i metodi MSF (Tabella 3). Inoltre, nel campione con un basso numero di larve, MSF ha recuperato il 500% in più di larve, fornendo una maggiore sensibilità al test e una maggiore possibilità di identificare l’organismo infestante. I frutti sono stati lavorati molto più velocemente utilizzando il metodo MSF rispetto al taglio; tagliare e ispezionare 5 frutti ha richiesto circa lo stesso tempo della lavorazione di 10 frutti tramite MSF. Figura 1: Fasi del protocollo di estrazione delle larve di moscerino della frutta. (A) Trattare circa 2 L in volume di frutta in una sola volta (ad esempio, 5 guaiave o 5 mango medi costituiscono campioni adeguati per questo metodo). (B) Tagliare il frutto in pezzi grandi e metterlo in un sacchetto da 4 L con chiusura a cerniera. (C) Aggiungere acqua al sacchetto fino a quando l’acqua copre il frutto tritato di 25-50 mm. (D) Spremere delicatamente il frutto a mano fino a quando tutta la polpa si è staccata dalla buccia e ha una consistenza liscia (cioè senza grossi pezzi). (E) Impilare il setaccio con il setaccio a maglie larghe (n. 8; 2,36 mm) in cima seguito dal setaccio a maglie piccole (n. 20; 0,85 mm). Per i primi stadi, posizionare un terzo setaccio (n. 45; 0,35 mm) sul fondo della pila. (F) Versare la polpa nel setaccio superiore. (G) Lavare accuratamente la polpa attraverso la pila di setacci usando acqua da un rubinetto, un tubo o una bottiglia fino a quando la polpa fine non è passata attraverso il primo setaccio. (H) Scansionare visivamente i setacci superiori alla ricerca di larve tardive che potrebbero essere state trattenute con la buccia o qualsiasi grande pezzo di frutta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Estrazione precoce e tardiva di Anastrepha suspensa dalla frutta raccolta in campo. Il numero medio (± errore standard della media [SE]) di larve di Anastrepha suspensa da cinque frutti di guava raccolti mediante taglio e ispezione visiva (taglio: 70,4 ± 11,9) o lavaggio della polpa attraverso una serie di tre setacci seguiti da ammollo della polpa in una soluzione di acqua zuccherata (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Il numero medio di larve (±SE) raccolte al minuto da 5 guaiave lavorate per talea (1,21 ± 0,16) e per MSF (3,71 ± 0,50) (B). Ogni metodo è stato replicato 5 volte e gli asterischi sopra le barre indicano differenze significative per il numero di larve (χ 2 = 6,81, p < 0,01) e il tempo di elaborazione (χ2 = 6,80, p < 0,01) sulla base di un test Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Validazione del metodo completo mushing-setacciatura-galleggiamento utilizzando l’infestazione manuale di mango e papaia per simulare una bassa infestazione da Bactrocera dorsalis. Il numero medio di larve di Bactrocera dorsalis (±SE) trovate in papaia (talea: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) e mango (talea: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frutti e il numero medio di larve (±SE) raccolte al minuto dalla papaia (talea: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) e mango (taglio: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frutti che sono stati lavorati utilizzando il metodo di talea o MSF (flottazione inclusa, n = 5) infestati manualmente da 5 larve di terzo stadio. Gli asterischi sopra le barre indicano differenze significative per il numero di larve trovate nella papaia (χ 2 = 5,39, p = 0,02) e mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) rispetto al taglio dei frutti basato sui test Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Validazione del metodo mushing-setacciatura (galleggiamento rimosso) utilizzando l’infestazione manuale di mango e papaia per simulare una bassa infestazione da Bactrocera dorsalis. Il numero medio di larve (±SE) trovate in papaia (talea: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) e mango (talea: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) frutti e numero medio di larve raccolte al minuto (±SE) in papaia (talea: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) e mango (taglio: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). I frutti sono stati infestati manualmente con 5 larve di Bactrocera dorsalis di terza stella e lavorati tagliando e ispezionando visivamente (tagliando) o ammucchiati in un sacchetto e lavati attraverso setacci (solo mushing e setacciatura, senza galleggiamento, n = 4). Gli asterischi sopra le barre indicano differenze significative per il numero di larve trovate nella papaia (χ 2 = 5,46, p = 0,02) e mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) e il tempo di elaborazione della papaia (χ 2 = 5,39, p = 0,02) e mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) rispetto al taglio dei frutti, sulla base dei test Kruskal-Wallis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Frutta # Frutta lavorata #Larvae aggiunto Modalità del trattamento #Larvae trovato Tempo di elaborazione (min)* % recupero Mango 25 25 Taglio 17 158 68% Mango 25 25 MSF 22 113 88% Papaya 16 20 Taglio 13 62 65% Papaya 16 20 MSF 16 40 80% *Tempo totale sommato su 5 lavoratori. Tabella 1: Il numero di larve recuperate e il tempo necessario per trattare i frutti mediante il metodo di taglio e ispezione visiva (taglio) o il metodo di mushing, setacciatura e galleggiamento completo (MSF). Il frutto di prova è stato infestato manualmente con 5 larve di terzo stadio mescolate con solo frutta annoiata e tappata (1 dei 5 manghi, 1 delle 4 papaie). Frutta # Frutta lavorata #Larvae aggiunto Modalità del trattamento #Larvae trovato Tempo di elaborazione (min)* % recupero Mango 20 20 Taglio 10 66 50% Mango 20 20 MS 19 44 95% Papaya 16 20 Taglio 5 38 25% Papaya 16 20 MS 17 25 85% *Tempo totale sommato su 4 lavoratori. Tabella 2: Il numero di larve recuperate e il tempo necessario per lavorare i frutti mediante taglio o mushing e setacciatura, omessa la flottazione (MS). I frutti di prova sono stati infestati manualmente da cinque larve di terzo stadio mescolate con solo frutta annoiata e tappata (1 su 5 mango, 1 su 4 papaia). Lavoratore/metodo #Fruit elaborati Tempo di elaborazione (min) #Larvae trovato taglio #Larvae trovato MSF* % della conta totale larve trovate tramite taglio Lavoratore 1: taglio 5 18 33 14 70% Lavoratore 2: taglio 5 18 1 5 17% Lavoratore 3: taglio 5 26 9 11** 75% Lavoratore 4: taglio 5 20 24 Lavoratore 5: MSF 10 22 NA 22 NA Lavoratore 6: MSF 10 18 NA 37 NA * Polpa proveniente dal taglio e ispezione visiva elaborata nuovamente utilizzando il metodo MSF per determinare il numero di larve tardive di 2-3° stadio mancate ** Polpa dei lavoratori 2 e 3 frutti raggruppati prima della trasformazione con il metodo MSF Tabella 3: Il numero di larve trovate nella guava raccolta sul campo tagliando e ispezionando visivamente il frutto (talea) o mushing, setacciando e galleggiando (MSF) il frutto.

Discussion

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modo efficiente ed efficace per trovare larve di tefritidi sul campo. La motivazione del lancio di un programma di eradicazione o della creazione di un’area di quarantena è il rilevamento di femmine o larve accoppiate6, che indica una popolazione riproduttiva. L’attuale metodo di taglio e ricerca visiva dei frutti è inefficiente nel trovare le larve poiché di solito sono presenti molti più frutti ospiti di quelli che possono essere ispezionati individualmente. Inoltre, le popolazioni dei tefritidi sono probabilmente basse in un’area di nuova invasione, rendendo incredibilmente difficili le possibilità di trovare larve in una grande quantità di frutti. Ad esempio, nel programma di eradicazione della Bactrocera dorsalis del 2015 in Florida, sono state identificate 54 diverse specie ospiti e sono stati tagliati più di 4.000 frutti. In questo programma di eradicazione, solo poche larve sono state trovate nel mango e nessun altro ospite è stato trovato infestato6. Abbiamo scoperto che il metodo MSF / MS era sia più sensibile che più veloce nel rilevare le larve di A. suspensa e B. dorsalis durante la lavorazione di frutti che avevano una grande quantità di polpa (mango, guava e papaia) alla rinfusa rispetto al taglio della frutta. La maggiore quantità di frutti ospiti che è possibile ispezionare utilizzando il metodo mushing e setacciatura, combinata con l’aumento del rilevamento di una larva rara, potrebbe aumentare la probabilità che un’infestazione venga trovata precocemente. L’individuazione precoce di una popolazione riproduttiva potrebbe aumentare la probabilità di eradicazione e ridurre i costi del programma.

I nostri esperimenti hanno dimostrato che il numero di larve rilevate dai lavoratori che tagliano e ispezionano visivamente i frutti variava considerevolmente. I lavoratori che tagliano la frutta hanno perso il 50% e il 75% delle larve di B. dorsalis collocate rispettivamente nel mango e nella papaia. Al contrario, solo il 5% e il 15% delle larve sono mancati utilizzando il metodo MS per la lavorazione del mango e della papaia, rispettivamente. Analogamente, uno studio che ha valutato il taglio della frutta nei porti di entrata ha mostrato una notevole variazione nel numero di frutti e larve infestati trovati dagli ispettori8. Lo studio ha dimostrato che gli ispettori portuali esperti hanno perso il 64% -99% delle larve di A. suspensa e il 16% -82% della frutta infestata quando la frutta è stata tagliata e ispezionata visivamente8. I nostri risultati suggeriscono che il metodo di mushing e setacciatura potrebbe ridurre la probabilità che un lavoratore manchi di rilevare un frutto infestato.

La galleggiazione dello zucchero e dell’acqua calda sono protocolli accettati in un metodo di approccio sistemico per garantire che le ciliegie e i mirtilli siano privi di moscerini della frutta14. Un sottoinsieme di una spedizione viene schiacciato nella soluzione, dopodiché un ispettore scherma visivamente la superficie della soluzione zuccherina per la presenza di uova e larve. Sebbene sia possibile elaborare un numero maggiore di frutti rispetto al taglio dei singoli frutti, la probabilità di trovare larve utilizzando queste tecniche è ancora influenzata dall’abilità dell’ispettore, dallo stadio e dal numero di larve presenti e dal tipo di frutto8. Abbiamo scoperto che, come altri tefritidi, B. dorsalis e A. suspensa si staccano dalla polpa del frutto e galleggiano in superficie. È interessante notare che abbiamo scoperto che con larve più grandi, che sono l’obiettivo nei programmi di emergenza e di eradicazione in quanto possono essere identificate morfologicamente, compresa la flottazione dello zucchero non ha aumentato l’accuratezza del metodo. Infatti, l’aggiunta del metodo di galleggiamento ha aumentato il tempo di lavorazione del 90% per la papaia e del 48% per il mango. L’aumento del tempo di elaborazione e i materiali aggiuntivi (ad esempio, acqua, contenitori, zucchero, ecc.) non supportano operativamente l’aggiunta di questo passaggio durante la ricerca di grandi stelle sul campo. Il metodo di galleggiamento dello zucchero può essere appropriato quando l’obiettivo è quello di rilevare tutte le fasi, comprese le prime fasi, ad esempio nei porti di ingresso e nelle centrali ortofrutticole. Filtrare la soluzione zuccherina con un setaccio a maglie fini fornirebbe molto probabilmente la rilevazione più accurata delle uova e delle prime stelle larvali11,12.

Le tecniche MS e MSF funzionano bene con frutta che può essere facilmente mushed e ha un grande volume di polpa. Le larve di tefritidi tendono a scavare nella polpa del frutto, il che rende difficile il rilevamento visivo. Un aspetto critico dei metodi MS e MSF è separare le larve dalla polpa. Il processo di setacciatura rimuove la polpa, esponendo così le larve su schermi di setaccio. Allo stesso modo, il metodo dell’acqua zuccherata separa le larve dalla polpa facendo galleggiare le larve, mentre la polpa affonda sul fondo della padella. Le larve separate dalla polpa con i metodi MS o MSF sono facilmente osservabili muoversi sul vaglio o sulla superficie dell’acqua. Sebbene il metodo di mushing, setacciatura e facoltativamente galleggiante abbia notevolmente migliorato la velocità e l’accuratezza del rilevamento delle larve di tefritidi in importanti frutti ospiti, il processo potrebbe non essere appropriato per tutti i frutti. Ad esempio, la frutta ospite con polpa dura, come avocado verdi o frutta con un grande seme / nocciolo e una quantità relativamente piccola di polpa, come le mandorle tropicali, può essere più facile da lavorare tagliando a mano e ispezione visiva.

Abbiamo scoperto che i metodi MS e MSF erano più veloci quando veniva elaborato un numero relativamente piccolo di frutta (5-10). La differenza sarebbe probabilmente maggiore se venissero lavorate maggiori quantità di frutta, il che potrebbe essere necessario e tipico dei programmi di emergenza per la mosca della frutta. La rimozione della fase di galleggiamento ha ulteriormente aumentato la velocità di rilevamento senza compromettere la precisione del rilevamento di larve di tefritidi di grandi dimensioni (>3 mm). Abbiamo dimostrato che queste tecniche potevano essere portate sul campo, che simulava le condizioni vissute dai lavoratori durante un programma di emergenza di moscerini della frutta. I nostri studi indicano che i metodi per la SM possono consentire una rilevazione più tempestiva delle larve tardive e la successiva eradicazione delle popolazioni riproduttive di tefritidi. MSF potrebbe essere utilizzata per rilevare uova e early instars attualmente non presi di mira dai programmi di eradicazione.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alebria e Alejandra Canon per l’assistenza nella lavorazione della guava presso l’Università della Florida, Rick Kurashima, Jean Auth e Bruce Inafuku per l’aiuto nella valutazione del frutto infestato artificialmente alle Hawaii e Michael Stulberg per gli utili commenti sulle versioni precedenti del manoscritto. Questo progetto è stato finanziato in parte dall’USDA APHIS e dall’University of Florida Cooperative Agreement e sostenuto in parte dall’USDA-ARS (progetto 2040-22430-027-00D). I risultati e le conclusioni di questa pubblicazione preliminare non sono stati formalmente diffusi dall’USDA e non devono essere interpretati come una determinazione o una politica dell’agenzia. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte dell’USDA. L’USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
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Dish Pans Sterilite 06578012 White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords=
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EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
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No. 20 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4221 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 45 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4226 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 8 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4215 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
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Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
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