마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

모든 마우스 실험은 지방 당국(그리스 이오안니나 지역)의 승인을 받았으며 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 실험은 3R의 원리에 따라 수행되었습니다. 실험에 사용된 모든 CD-1 마우스는 그리스 이오안니나 대학교의 동물 사육장 시설에서 온도(22°C)와 습도(60%)가 조절된 방에서 사육하고 임의로 급여하였다. 동물집은 사육시설(EL33-BIObr01), 공급시설(EL33-BIOsup01), 실험시설(EL33BIO-exp01)을 운영할 수 있는 허가를 받았습니다. 1. 시약의 제조 디메틸 설폭사이드(DMSO)( 재료 표 참조)에 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 분말(재료 표 참조)을 최종 농도 200mM로 희석합니다. 10 μL 분취액을 첨가하고, -20 °C에서 보관한다. 1 개월 이내에 솔루션을 사용하십시오.참고: IBMX 분말은 -20°C에서 보관됩니다. 모든 면역형광 완충액을 준비하고, 4°C에서 보관한다.1개의 PBS 정제(재료 표 참조)를 200 mL의 ddH2Ο에 희석하여 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 제조한다. ddH2Ο 80 mL, HEPES 0.59575 g, PIPES 1.81422 g, EGTA 0.38035 g,MgCl2 0.04066 g을 첨가하여 PHEM 완충액을 만들고(재료 표 참조) 자기 교반기로 교반하면서(재료 표 참조), pH가 6.9에 도달할 때까지 NaOH(재료 표 참조)를 동시에 첨가합니다(pH/ORP 측정기를 사용하여 확인[재료 표 참조]). 그런 다음 ddH2Ο를 최종 부피 100mL에 추가합니다. PFA 분말(재료 표 참조)을 PHEM 완충액에 희석하여 파라포름알데히드-트리톤-X-100(PFA-Tx-4) 완충액을 준비하면서 최종 농도 4% PFA로 가열하면서 마그네틱 교반기로 교반합니다. 그런 다음 주사기와 0.2μm 필터(재료 표 참조)를 사용하여 버퍼를 필터링하고 0.5% Tx-100(재료 표 참조)을 추가합니다. 약 10mL의 PFA-Tx-100(PFA 0.4g, Tx-100 50μL)을 준비하여 1회 실험에 충분합니다. 최대 1주일 동안 4°C에서 보관하십시오.주의 : PFA를 다룰 때는 장갑을 착용하고 피부와 눈에 닿지 않도록 하십시오. PBS에 소 혈청 알부민(최종 농도: 0.5% w/v BSA)( 재료 표 참조)을 첨가하여 세척 완충액을 준비하고 기계적으로 교반합니다. 곰팡이 및 박테리아 오염의 위험을 최소화하기 위해 1:1,000 희석으로 10% w/v NaN3 완충액(아지드화나트륨)을 추가합니다. 10mL의ddH2O 에 1g의NaN3 분말( 재료 표 참조)을 첨가하여 10% w/v NaN3완충액을 만듭니다. NaN3 완충액을 실온에서 보관한다. PBS에 BSA(최종농도: 3% w/v)를 첨가하고 기계적으로 교반하여 블로킹 버퍼를 준비합니다. 10%NaN3 완충액을 1:1,000 희석액으로 첨가합니다. 2. 해부된 난소에서 GV 난모세포 수집 및 DSB 유도 알림: 모든 도구와 용액은 멸균되어야 합니다. 난모세포 취급은 입체 현미경(재료 표 참조)에서 구강 피펫을 사용하여 수행되며 모든 방울은 미네랄 오일로 덮여 있습니다(재료 표 및 그림 1E 참조). 자궁경부 탈구로 마우스를 도태하기 전에 46-48시간 동안 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)의 7개 국제 단위(IU)( 재료 표 참조)를 마우스에 복강 주사합니다.참고: 사용된 모든 마우스는 8-12주령이어야 합니다. M2 배양 배지 (재료 표 참조)를 주사기 및 0.2 μm 필터로 여과하고, 14 mL 둥근-바닥 튜브 (재료 표 참조)에서 최종 농도 200 μM까지 IBMX 200 mM을 첨가하여 난모세포가 프로페이즈 I에서 정지되도록 유지하였다. 그런 다음 플라스틱 조직 배양 접시에 M2-IBMX 배지 방울을 준비하고(재료 표 참조) 난모세포 분리 전에 37°C에서 최소 30분 동안 핫 블록(재료 표 참조)에 놓습니다. M2를 4 °C에서 보관하십시오. 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생시키고 난소를 해부한 다음 M2-IBMX가 있는 5mL 둥근 바닥 튜브( 재료 표 참조)에 넣습니다. 난소를 1.5mL의 M2-IBMX가 들어 있는 플라스틱 뚜껑으로 옮기고, 난소주위 지방 조직 또는 나팔관 세그먼트를 제거하고, 27G 바늘로 난소를 기계적으로 천공하여 COC를 방출합니다(재료 표 및 그림 1A-C 참조). COC를 M2-IBMX 방울(각각 약 25-30μL)이 있는 배양 접시로 옮기고 좁은 구멍 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 반복 피펫팅하여 적운 세포를 제거합니다( 재료 표 및 그림 1D 참조). SN GV-단계 난모세포를 선택하고 빛으로부터 보호되는 37°C의 핫 블록에 M2-IBMX 배지 한 방울(25μL)로 옮깁니다(그림 1F).SN 난모세포는 핵이 말초에 위치하는 NSN 난모세포와 대조적으로 더 큰 크기와 중앙에 배치된 핵을 기준으로 찾는다21. 어쨌든, GV 난 모세포 (SN 또는 NSN)의 유형에 대한 최종 결정을 내리기 전에 컨포칼 현미경으로 DNA 구성을 관찰하십시오. 에토포사이드를 사용하여 DSB를 유도합니다( 재료 표 참조). GV-stage 난모세포를 37°C의 고온 블록 상에서 1시간 동안 유전독성제의 한 방울(각각 25 μL)에 넣고 암실에서 두었다.참고: 에토포사이드는 DNA22에 DSB를 도입하는 토포이소머라제 II 억제제입니다. 에토포사이드를 빛으로부터 보호되는 실온에서 20mg/mL의 10μL 분취량으로 보관하십시오. 테스트된 농도는 5μg/mL, 20μg/mL 및 50μg/mL입니다. GV-단계 난모세포를 장기간 정지된 상태로 유지하려면, 난모세포를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터(재료 표 참조)에서 400μM IBMX로 보충된 M16 배양 배지(재료 표 참조)의 방울에 넣습니다. M16을 4°C에서 보관하고, 주사기 및 0.2 μm 필터로 배지를 여과하고, 사용하기 전에 적어도 1시간 동안 배양한다. 그림 1: 난모세포 분리 과정 . (A) IBMX를 사용한 M2 배지의 난소에서 난소주위 지방 조직 및 남은 나팔관 세그먼트 제거. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 사진. 스케일 바 = 1mm. (B) IBMX가 있는 M2 배지에서 분리된 난소. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 이미지. 스케일 바 = 1mm. (C) IBMX가 있는 M2 배지에서 27G 바늘을 사용하여 난소의 기계적 천공. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 이미지. 스케일 바 = 1mm. (D) IBMX를 사용한 M2 배지에서 천공 후 난소에서 방출된 COC. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (E) 구강 피펫을 이용한 난모세포 수집. (F) 주변 난구를 제거한 후 IBMX가 있는 M2 배지에서 탈락한 난모세포. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 난모세포 고정 및 면역형광 참고: 난모세포 취급은 입체 현미경으로 입 피펫을 사용하여 수행되며 모든 방울은 미네랄 오일로 덮여 있습니다. 대조군과 에토포시드 처리된 GV 난모세포를 PFA-Tx-100 완충액과 함께 상이한 플라스틱 조직 배양 접시에 실온에서 40분 동안 넣습니다. 실온에서 세척 완충액(각각 50 μL)의 3가지 다른 방울로 난모세포를 세척합니다. 각 방울에 난모세포를 5분 동안 그대로 두십시오. 난모세포를 37°C의 핫 블록 상에서 1시간 동안 블로킹 완충액(각각 25μL)의 방울에 넣습니다. γH2AX(rabbit phospho-Η2ΑΧ)(Ser139)를 인식하는 1차 항체를 준비합니다( 재료 표 참조)(원액: 1mg/mL). 차단 완충액에 1:200 희석액을 사용하고 4°C에서 밤새 1차 항체(각각 15μL)의 한 방울에 난모세포를 넣습니다.참고: Phospho-Η2ΑΧ (γH2AX)는 체세포와 GV 난모세포 모두에서 DSB를 검출하는 일반적인 마커이다18,23. 다음날, 실온에서 세척 완충액(각각 50 μL)의 3가지 다른 방울로 난모세포를 세척합니다. 각 방울에 난모세포를 5분 동안 그대로 두십시오. 2차 항체인 Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit( 재료 표 참조)(원액: 2mg/mL)을 준비합니다. 차단 완충액에 1:200 희석액을 사용하고 빛으로부터 보호된 37°C의 핫 블록에서 1시간 동안 2차 항체(각각 15μL) 방울에 난모세포를 넣습니다. 난모세포를 투과된 세포에서만 DNA를 염색하는 원적외선 형광 DNA 염료인 DRAQ7(각 25μL)(원액: 0.3mM, 재료 표 참조) 방울로 옮깁니다. 어두운 조건에서 실온에서 10분 동안 세척 완충액에 1:250 희석하여 사용하십시오. 실온에서 세척 완충액(각각 50 μL)의 3가지 다른 방울로 난모세포를 세척합니다. 각 방울에 5분 동안 그대로 둔 다음 컨포칼 현미경 검사를 위해 35mm 유리 바닥 페트리 접시( 재료 표 참조)에 있는 세척 완충액의 작은 방울(각각 약 5μL)로 옮깁니다(그림 2A).참고: DNA 염색과 2차 항체의 세척이 동시에 수행됩니다. 4. 컨포칼 현미경 참고: 공초점 현미경 검사는 유리 바닥 접시에 난모세포를 배치한 후 형광 강도가 감소하는 것을 방지하기 위해 즉시 수행해야 합니다. 전동 스테이지가 있는 컨포칼 현미경( 재료 표 참조)에 대한 접근이 필요합니다. 현미경 설정공초점 시스템에서 레이저 컨트롤러, 레이저, 현미경 컨트롤러, 투과광용 램프 및 PC를 켭니다(그림 2B, D). 컨포칼 소프트웨어를 열고 40x 오일 렌즈를 선택합니다. 접시를 표본 홀더에 놓고 조이스틱을 사용하여 XY 및 Z축에서 스테이지를 이동하여 난모세포에 초점을 맞춥니다(그림 2C). 난모세포 스캐닝포화를 최소화하기 위해 각 실험에 대해 레이저 출력, 게인 및 핀홀 크기를 독립적으로 설정합니다. 각 난모세포에 대해 관심 영역, 특히 DNA 영역의 핵을 설정합니다. DNA 영역의 경계를 정의하고 z 스텝 크기를 3μm로 조정합니다. 그런 다음 스캔을 시작합니다. 선택한 폴더의 각 셀에 대한 이미지를 저장합니다. 스캔이 완료되면 소프트웨어를 종료하고 컴퓨터를 종료한 다음 레이저 컨트롤러, 레이저, 현미경 컨트롤러 및 투과광용 램프를 끕니다. 그림 2: 컨포칼 현미경 . (A) 면역형광 프로토콜 및 DNA 염색을 수행한 후 난모세포를 별도의 세척 완충액 방울에 고정하고, 미네랄 오일로 덮고, 유리 바닥 접시에 넣고, 공초점 현미경 이미징을 위해 준비합니다. 각 드롭에는 다른 실험 범주가 포함되어 있습니다. 실체 현미경 접안렌즈를 통해 얻은 이미지. 스케일 바 = 확대 부분의 경우 1mm/100μm. (B) 컨포칼 현미경 스테이지에 배치된 유리 바닥판. (C) 컨포칼 현미경을 통해 얻은 난모세포의 명시야 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (D) 컨포칼 현미경 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 5. 이미징 분석 브라우저(https://imagej.net/software/fiji/downloads)에서 Fiji ImageJ-win64를 다운로드하여 열고 데이터를 TIFF 스택 파일로 가져옵니다.참고: 각 난모세포 파일을 별도로 엽니다. 이미지 | 색상 | 채널 분할을 클릭하여 모든 채널을 분할합니다. LUT(Look up Table)를 클릭하고 각 채널에 대해 선호하는 색상을 선택합니다. 이미지 | 색상 | 채널 병합 γΗ2ΑΧ 및 DNA에 대한 채널을 병합합니다. 명시야 채널을 병합하지 않은 상태로 둡니다. NSN 난모세포 및 낮은 수준의 DNA 손상을 갖는 SN 난모세포에서, γΗ2ΑΧ는 DNA 영역에서 병소로서 검출된다. 이 경우 “멀티 포인트”또는 포인트 명령을 클릭하고 DNA와 일치하는 모든 γΗ2ΑΧ 초점을 선택하십시오. 모든 스택에 대해 이 단계를 반복합니다. 높은 수준의 DNA 손상을 가진 SN 난모세포에서 γΗ2ΑΧ 신호는 전체 DNA 영역에 분포합니다. 이 경우 이미지 | 스택 | Z 프로젝트를 선택하고 [자유형 선택] 명령을 사용하여 전체 DNA 영역을 선택합니다. γΗ2ΑΧ 형광을 측정하려면 분석 | 측정하고 측정값을 .xlsx 파일에 복사합니다. 그런 다음 평균 형광을 계산하고, 값을 정규화하고, 그래프를 만들기 전에 초점 수를 계산합니다. Analyze( 분석) | 배율 설정(Set Scale )을 클릭하여 배율을 설정한 다음 분석(Analyze) | 도구 | 스케일 바 를 사용하여 채널에 스케일 바를 추가합니다.