Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten
Summary
Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.
Abstract
Dubbele strengsbreuken (DSB’s) zijn een van de ernstigste laesies die kunnen optreden in celkernen, en als ze niet worden gerepareerd, kunnen ze leiden tot ernstige resultaten, waaronder kanker. De cel is daarom voorzien van complexe mechanismen om DSB’s te repareren, en deze routes omvatten histon H2AX in zijn gefosforyleerde vorm bij Ser-139 (namelijk γH2AX) en p53-bindend eiwit 1 (53BP1). Aangezien beide eiwitten foci kunnen vormen op de plaatsen van DSB’s, wordt identificatie van deze markers beschouwd als een geschikte methode om zowel DSB’s als hun kinetiek van reparatie te bestuderen. Volgens de moleculaire processen die leiden tot de vorming van γH2AX- en 53BP1-foci, zou het nuttiger kunnen zijn om hun co-lokalisatie in de buurt van de DSB’s te onderzoeken om een alternatieve aanpak op te zetten die het mogelijk maakt DSB’s te kwantificeren door de gelijktijdige detectie van twee DNA-schademarkers. Dit protocol heeft dus tot doel de genomische schade te beoordelen die in menselijke lymfocyten wordt veroorzaakt door het radiomimetische agens bleomycine door de aanwezigheid van γH2AX en 53BP1-foci in een dubbele immunofluorescentie. Met behulp van deze methodologie hebben we ook de variatie in het aantal γH2AX- en 53BP1-foci in de loop van de tijd afgebakend, als een voorlopige poging om de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB’s te bestuderen.
Introduction
DNA-schade wordt continu geïnduceerd door agentia die endogeen kunnen zijn, zoals ROS gegenereerd door cellulair oxidatief metabolisme, of exogene, zowel chemicaliën als fysisch1. Een van de meest schadelijke laesies spelen dubbelstrengsbreuken (DSB’s) een fundamentele rol bij het bijdragen aan genomische instabiliteit, omdat ze chromosoomafwijkingen veroorzaken die op hun beurt het carcinogeneseproces kunnen initiëren. Zo worden cellen voorzien van complexe en efficiënte mechanismen van DSB’s die repareren2.
Wanneer een DSB optreedt, activeert de cel de DNA-schaderespons (DDR) waarbij, samen met het MRE11 / RAD50 / NBS1-complex, ATM- of ATR-kinasen worden gerekruteerd om andere eiwitten te activeren die de celcyclus vertragen of stoppen3. Een essentieel doelwit van deze kinasen is histon H2AX, dat wordt gefosforyleerd op Ser-139 binnen enkele megabases van de DSB’s (namelijk γH2AX), waardoor de rekrutering van verschillende reparatiefactoren mogelijk is, zoals onder andere BRCA1 en p53-bindend eiwit 1 (53BP1)3. Later wordt één route tussen homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of enkelstrengsgloeiing (SSA) geactiveerd om de DSB’s 4,5 te repareren. Daarom is 53BP1 betrokken bij het dicteren van de keuze tussen HR of NHEJ, voornamelijk het bevorderen van de activering van NHEJ in plaats van HR6. Bovendien kunnen zowel de gefosforyleerde vorm van H2AX-histon als 53BP1 foci vormen op de plaatsen van DSB’s. Aangezien deze foci blijven bestaan totdat de integriteit van de dubbele streng is hersteld, wordt het beoordelen van het verschijnen/verdwijnen van γH2AX of 53BP1 foci binnen een tijdsinterval beschouwd als een nuttige methode om het optreden en herstel van DSB’s in een celsysteemte evalueren 6,7. Volgens de hierboven beschreven moleculaire processen kan het echter nuttig zijn om, aangezien γH2AX en 53BP1-foci naar verwachting samen in de buurt van de DSB’s zullen lokaliseren tijdens DDR8,9, tegelijkertijd de aanwezigheid van deze markers in een dubbele immunofluorescentie te detecteren.
Het doel van dit manuscript was dus om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van γH2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door het radiomimetische middel bleomycine te beoordelen. Met behulp van dezelfde methodologie probeerden we ook de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB’s af te bakenen volgens een eerder opgezette experimentele procedure10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofluorescentieanalyse van γH2AX en 53BP1 foci is een geschikte methode voor het beoordelen van genomische schade in interfasekernen van een celsysteem. Deze procedure heeft verschillende kritieke punten die de uitkomst van de experimenten kunnen beïnvloeden, voornamelijk de middelen die worden gebruikt bij fixatie en permeabilisatie, het type antilichamen en hun verdunningsfactoren en de concentratie van het mutagene beeld.
Het behoud van eiwitintegriteit is van fundamenteel belang, omd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de volbloeddonoren en al het gezondheidspersoneel dat de bloedmonsters heeft genomen dankbaar.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
Riferimenti
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
