Optimerad produktion och analys av rekombinanta proteinfyllda vesiklar från E. coli

Det bakteriella arbete som utförs följer de lokala, nationella och internationella bestämmelserna om biosäkerhet som passar den särskilda biosäkerhetsrisknivån för varje stam. 1. Val av olika virtuella nätverk Identifiera VNp-sekvenserna.OBS: För den aktuella studien har tre VNp-sekvenser identifierats1 som resulterar i maximalt utbyte och vesikulär export av de proteiner som hittills undersökts: VNp2, VNp6 och VNp15. Det är för närvarande inte klart varför vissa VNp-varianter fungerar mer effektivt med vissa proteiner än andra; därför rekommenderas att fusioner genereras mellan ett nytt protein av intresse med varje VNp-variant (dvs. VNp2, 6 eller 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEPlasmider som tillåter uttryck av proteinet av intresse med olika VNp-aminoterminalfusioner har gjorts kommersiellt tillgängliga (se materialtabell). Designa en kloningsstrategi för att infoga genen av intresse vid 3′-änden av cDNA-kodningen för VNp i en av dessa konstruktioner, eller anpassa en befintlig plasmid genom att integrera syntetiserat VNp cDNA uppströms det första ATG-kodonet i genen som kodar för proteinet av intresse. Använd metoderna som beskrivs i1. För giftiga proteiner, använd en vektor med en repressibel uttryckspromotor eller en promotor med minimalt oinducerat uttrycksbrus. Klona VNp-sekvenstaggen vid aminoterminalen i fusionsproteinet. Se till att affinitetstaggarna, proteasklyvningssekvenserna etc. och proteinet av intresse är placerade på karboxylsidan av VNp-taggen. Det rekommenderas att separera VNp från nedströmspeptiden med ett flexibelt länkområde, såsom två eller tre upprepningar av en -G-G-S-G- polypeptidsekvens (figur 1).OBS: Använd plasmider med ett antibiotiskt urval som inte riktar sig mot peptidoglykan, vilket försvagar cellytan och minskar vesikelutbytet. Kanamycin och kloramfenikol (se materialtabell) var de föredragna antibiotika som användes för denna studie. 2. Bakteriell cellodling och proteininduktion OBS: Bakteriestammar som vanligtvis används i detta protokoll är antingen Escherichia coli BL21 (DE3) eller W3110. E. coli-celler odlas i lysogenbuljong (LB) (10 g / L trypton; 10 g / L NaCl; 5 g / L jästextrakt) eller fantastisk buljong (TB) (12 g / L trypton; 24 g / L jästextrakt; 4 ml / L 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, salter autoklaver separat) media (se Materialförteckning). Exempelbilder som visar varje steg i proteininduktionen och efterföljande isolerings- och reningsprocess visas i figur 2. Odla 5 ml LB-startmotorer från färska bakterieomvandlingar vid 37 °C till mättnad och använd dem för att inokulera 25 ml TB i en 500 ml konisk kolv, alla med lämpligt antibiotiskt val. Förhållandet yta:volym är en viktig faktor för att optimera detta system. Använd en kolv med så stor volym som möjligt (t.ex. 5 L kolv innehållande 1 liter kultur; för optimeringskörningar, använd 25 ml media i en 500 ml kolv). Inkubera de större skakkolvkulturerna i en inkubator vid 37 °C med skakning vid 200 rpm (≥25 mm orbitalkast) tills ett optiskt densitetsvärde på 600 nm (OD600) på 0,8–1,0 uppnås.OBS: Vesikulering är optimal när celler odlas vid 37 °C. Vissa rekombinanta proteiner kräver emellertid uttryck i lägre temperaturer. Om detta är fallet för proteinet av intresse måste VNp6-taggen användas, eftersom detta möjliggör export av vesikeler med hög avkastning vid temperaturer ner till 25 °C. För att inducera rekombinant proteinuttryck från T7-promotorn, tillsätt isopropyl β-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration på upp till 20 μg/ml (84 μM) (se materialtabell). Induktionen av rekombinant proteinuttryck måste ske vid den sena logfasen (dvs. typisk OD600 på 0,8-1,0) för produktion av blåsor.OBS: Induktionsperiodens längd kan skilja sig åt mellan proteiner, där vissa når maximal produktion vid 4 timmar och andra över natten (18 timmar). Hittills har maximal vesikelexport erhållits i övernattningskulturer. 3. Rekombinant vesikelisolering Pelletera cellerna genom centrifugering vid 3 000 x g (4 °C) i 20 minuter. För att sterilisera vesikelinnehållande media för långtidsförvaring, passera det rensade odlingsmediet genom ett sterilt och tvättmedelsfritt 0,45 μm polyetersulfonfilter (PES) (se Materialförteckning).Anmärkning: För att testa uteslutningen av viabla celler från det vesikelinnehållande filtratet, platta på LB-agar och inkubera över natten vid 37 °C. För att koncentrera vesiklarna till en mindre volym, passera det sterila vesikelinnehållande mediet genom ett sterilt och tvättmedelsfritt 0,1 μm blandat cellulosaestrar (MCE) filter (se materialförteckning). Tvätta försiktigt membranet med 0,5-1 ml steril PBS med en cellskrapa eller plastspridare för att försiktigt avlägsna blåsor från membranet. Överför till ett nytt mikrofugerör.OBS: Renade vesiklar kan förvaras i steril media eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 °C. Det finns exempel på rekombinanta proteiner lagrade i dessa vesiklar i 6 månader, på detta sätt, utan förlust av enzymatisk aktivitet. 4. Löslig proteinfrisättning från isolerade vesiklar När proteininnehållande vesiklar har isolerats i sterila medier / buffert, utsätt vesikulära lipidmembran för ultraljudsbehandling med hjälp av ett lämpligt schema för apparaten (t.ex. 6x 20 s på och av cykler) och centrifugera vid 39 000 x g (4 ° C) i 20 minuter för att avlägsna vesikelskräp.OBS: Osmotisk chock eller tvättmedelsbehandling kan användas som ett alternativ för att bryta upp blåsorna, men hänsyn måste tas till påverkan på proteinfunktionalitet och/eller nedströms applicering. Om VNp-fusion förblir cytosolisk och inte släpps ut i media, isolera proteinet med standardprotokoll (t.ex. resuspendera cellpelletsna i 5 ml av en lämplig extraktionsbuffert (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikat och ta bort cellskräpet genom centrifugering). 5. Bestämning av proteinkoncentration Bestäm koncentrationen av proteiner genom geldensitometrianalys av triplikatprover1. Kör tillsammans med bovint serumalbumin (BSA) laddningsstandarder på coomassie-färgade natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) geler. Skanna och analysera gelerna med lämplig programvara (t.ex. bild J; se materialförteckning). 6. Visualisering av vesikelbildning och isolerade vesiklar genom fluorescensmikroskopi OBS: Om cellerna innehåller fluorescerande märkta VNp-fusions- eller membranmarkörer kan levande cellavbildning användas för att följa vesikelbildning. Alternativt kan fluorescerande lipidfärgämnen användas för att visualisera vesiklar för att bekräfta produktion och rening. Montering av cellerInducera VNp-fusionsuttryck i flera timmar innan du monterar på täckglaset. Agarosdyna (figur 3A-C): pipettera cellerna på en tunn (<1 mm), cirkulär LB-agaros (2%) dyna som har fått bildas och satts på en ren glasskiva. Låt cellerna sätta sig och balansera och placera ett 50 mm x 25 mm täckglas på dynan och cellerna. Håll täckglaset på plats med distanser och tejp. Polyeteniminmetod (PEI) (figur 3D–F): sprid 20 μl 0,05 % PEI (i dH2O) på ett täckglas med pipettspets och låt stå i 3–5 minuter för att binda till glas utan att låta torka. Tillsätt 50 μL cellodling och låt verka i 5-10 minuter för att säkerställa att bakterier har associerats med den PEI-belagda ytan4. Tvätta täckglaset med 100 μl media innan du placerar det på objektglaset och håll det på plats med distanser och tejp. Montering av blåsorPipettera renade vesiklar på en tunn (<1 mm), cirkulär LB-agaros (2%) dyna som har fått formas och satts på en ren glasskiva. När vätskan har torkat, placera ett 50 mm x 25 mm täckglas på dynan och blåsorna. Håll täckglaset på plats med distanser och tejp. Det fluorescerande lipidfärgämnet FM4-64 kan färga membran5 och kan därför användas för att visualisera vesiklar. Tillsätt FM4-64 (se materialförteckning) till renade vesiklar vid en slutlig koncentration av 2 μM (från en 2 mM stam upplöst i dimetylsulfoxid [DMSO]) och avbilda efter en 10 minuters inkubation. Detta är särskilt användbart för att identifiera vesiklar som innehåller icke-fluorescerande märkta laster5. Skölj täckglasen med samma media som används för att odla de observerade cellerna.OBS: Vissa komplexa medier (t.ex. TB) kan uppvisa autofluorescens, vilket kan resultera i överskott av bakgrundssignal. Avbildning av vesiklarOBS: Exempel på mikroskopibilder av VNp rekombinanta vesiklar kan ses i figur 4.Montera glaset på ett inverterat mikroskop (se Materialförteckning) med hjälp av ett oljenedsänkningsmål och låt stå i 2-3 minuter så att provet kan sätta sig och temperaturen balanseras.OBS: All levande cellavbildning för varje prov måste slutföras inom 30 minuter efter montering av celler på täckglas för att minimera effekterna av fototoxicitet och anaerob stress. Av denna anledning föredras bilder med ett plan framför z-stacks. Använd lämpliga ljuskällor (t.ex. lysdiod [LED] eller halogenlampa; se Materialförteckning) och filterkombinationer för det eller de fluorescerande proteiner/färgämnen som används6. Använd en lins med hög förstoring (dvs. 100x eller 150x) och hög numerisk bländare (dvs. NA ≥1,4) för avbildning av mikrobiella celler och blåsor. Bestäm den minimala ljusintensitet som krävs för att visualisera fluorescenssignaler från celler och / eller vesiklar. Detta kan kräva viss justering av exponerings- och förstärkningsinställningarna för kameran som används.OBS: Typiska exponeringstider från nuvarande komplementära metalloxidhalvledarkameror (CMOS) varierar mellan 50-200 ms beroende på bildsystemet. För bilder med en ram använder du medelvärdet med tre bilder för att minska maskinvaruberoende slumpmässigt bakgrundsbrus. För timelapse-avbildning, tillåt 3-5 minuter mellan enskilda ramar.OBS: Beroende på mikroskopinställningen kan fokus behöva justeras intermittent under längre tidsfördröjningsexperiment.