वर्तमान प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के जीवाणु उत्पादन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है, जिसमें आमतौर पर अघुलनशील या डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड युक्त प्रोटीन शामिल हैं, जो बाह्य झिल्ली-बाध्य पुटिकाओं के अंदर पैक किए जाते हैं। इसमें लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा सहित वैज्ञानिक अनुसंधान के बहुमुखी क्षेत्रों पर लागू होने की क्षमता है।
यह अभिनव प्रणाली, एक लघु पेप्टाइड टैग का उपयोग करके, जो ई कोलाई से झिल्ली बद्ध पुटिकाओं में कई पुनः संयोजक प्रोटीन का निर्यात करती है, बैक्टीरिया पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति से जुड़ी समस्याओं की एक श्रृंखला के लिए एक प्रभावी समाधान प्रदान करती है। ये पुनः संयोजक पुटिकाएं एक सूक्ष्म वातावरण के भीतर प्रोटीन को विभाजित करती हैं जो बैक्टीरिया से प्रोटीन युक्त अन्यथा चुनौतीपूर्ण, विषाक्त, अघुलनशील, या डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है। पुटिका-न्यूक्लिटिंग पेप्टाइड टैग की अनुपस्थिति में विशिष्ट जीवाणु अभिव्यक्ति की तुलना में प्रोटीन की उपज में काफी वृद्धि हुई है। पुटिका-पैक किए गए प्रोटीन की रिहाई संस्कृति माध्यम से अलगाव का समर्थन करती है और दीर्घकालिक सक्रिय प्रोटीन भंडारण की अनुमति देती है। यह तकनीक लागू जैव प्रौद्योगिकी से लेकर खोज विज्ञान और चिकित्सा तक अनुप्रयोगों की एक विविध श्रृंखला के लिए सरलीकृत डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए पुटिका-पैक किए गए, कार्यात्मक प्रोटीन की पैदावार में वृद्धि को जन्म देती है। वर्तमान लेख और संबंधित वीडियो में, विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिका उत्पादन को अधिकतम करने के लिए कार्यप्रणाली में महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालता है।
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया ई कोलाई औद्योगिक और शैक्षणिक दोनों पैमाने पर पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए एक आकर्षक प्रणाली है। यह न केवल उच्च घनत्व वाले बैचों में संस्कृति के लिए लागत प्रभावी और सीधा है, बल्कि ई कोलाई1 में कार्यात्मक प्रोटीन की पीढ़ी को बढ़ावा देने के लिए अभिकर्मकों, उपभेदों, उपकरणों और प्रमोटरों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम स्थापित किया गया है। इसके अतिरिक्त, सिंथेटिक जीव विज्ञान तकनीक अब आम तौर पर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और जटिल प्रोटीन2 के तह के आवेदन से संबंधित बाधाओं पर काबू पा रही है। संस्कृति मीडिया में पुनः संयोजक प्रोटीन के स्राव को लक्षित करने की क्षमता उपज में सुधार और विनिर्माण लागत को कम करने के लिए आकर्षक है। झिल्ली पुटिकाओं में उपयोगकर्ता-परिभाषित प्रोटीन की नियंत्रित पैकेजिंग लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा उद्योगों के भीतर उत्पादों और प्रौद्योगिकियों के विकास में सहायता करती है। अब तक, ई कोलाई 3 से पुनः संयोजक प्रोटीन को स्रावित करने के लिए व्यापक रूप से लागू तरीकों की कमी रही है।
ईस्टवुड एट अल ने हाल ही में ई कोलाई1 से पुनः संयोजक प्रोटीन युक्त पुटिकाओं के उत्पादन और पृथक करने के लिए एक पेप्टाइड टैगिंग-आधारित विधि विकसित की है। यह पुटिका न्यूक्लिटिंग पेप्टाइड (वीएनपी) बाह्य जीवाणु झिल्ली पुटिकाओं के उत्पादन की अनुमति देता है, जिसमें लक्ष्य प्रोटीन के शुद्धिकरण और भंडारण को सरल बनाने के लिए पसंद के पुनः संयोजक प्रोटीन को लक्षित किया जा सकता है, और सामान्य रूप से फ्लास्क संस्कृतियों को हिलाने से अनुमति देने की तुलना में काफी अधिक पैदावार की अनुमति देता है। फ्लास्क कल्चर के प्रति लीटर पुनः संयोजक प्रोटीन के करीब 3 ग्राम की पैदावार की सूचना दी गई है, जिसमें वीएनपी टैग की कमी वाले समकक्ष प्रोटीन की तुलना में >100 गुना अधिक पैदावार होती है। इन पुनः संयोजक प्रोटीन-समृद्ध पुटिकाओं को संस्कृति मीडिया से तेजी से शुद्ध और केंद्रित किया जा सकता है और भंडारण के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान किया जा सकता है। यह तकनीक ई कोलाई पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन में एक बड़ी सफलता का प्रतिनिधित्व करती है। पुटिकाएं घुलनशील और कार्यात्मक रूप में प्रोटीन युक्त विषाक्त और डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड को विभाजित करती हैं, और दीर्घकालिक भंडारण याप्रत्यक्ष प्रसंस्करण के लिए पुटिका-पैक किए गए, कार्यात्मक प्रोटीन के सरल, कुशल और तेजी से शुद्धिकरण का समर्थन करती हैं।
वर्तमान तकनीकों पर इस तकनीक के प्रमुख लाभ हैं: (1) आकार (1 केडीए से >100 केडीए) और प्रोटीन के प्रकार की एक श्रृंखला के लिए प्रयोज्यता; (2) अंतर-और अंतर-प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड गठन को सुविधाजनक बनाना; (3) मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स पर लागू; (4) प्रमोटरों और मानक प्रयोगशाला ई कोलाई उपभेदों की एक श्रृंखला के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है; (5) हिलने वाले फ्लास्क से प्रोटीन की पैदावार की पीढ़ी आमतौर पर केवल किण्वन संस्कृतियों के साथ देखी जाती है; प्रोटीन को झिल्ली बद्ध पुटिकाओं में निर्यात और पैक किया जाता है जो (6) सक्रिय घुलनशील प्रोटीन के भंडारण के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान करते हैं; और (7) डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और प्रोटीन शुद्धिकरण को सरल बनाता है। यह सरल और लागत प्रभावी पुनः संयोजक प्रोटीन उपकरण जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा उद्योगों के साथ-साथ खोज विज्ञान पर सकारात्मक प्रभाव डालने की संभावना है।
यहां, कई वर्षों में विकसित एक विस्तृत प्रोटोकॉल, वीएनपी तकनीक के साथ बैक्टीरिया से पुनः संयोजक प्रोटीन से भरे पुटिकाओं का उत्पादन करने के लिए इष्टतम स्थितियों का वर्णन करता है। व्यवहार में इस प्रणाली की उदाहरण छवियां दिखाई जाती हैं, जिसमें एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया जाता है, जिससे उत्पादन, शुद्धिकरण और एकाग्रता के विभिन्न चरणों के दौरान पुटिकाओं की उपस्थिति की कल्पना की जा सकती है। अंत में, बैक्टीरिया से वीएनपी संलयन युक्त पुटिकाओं के उत्पादन को मान्य करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के तरीके पर मार्गदर्शन प्रदान किया जाता है।
ऊपर वर्णित पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एमिनो-टर्मिनल पेप्टाइड-टैग की गई विधि एक सरल प्रक्रिया है, जो लगातार बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उत्पादन करती है जिसे महीनों तक कुशलतापूर्वक अलग और / या संग्रहीत किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों को उजागर करना महत्वपूर्ण है जो इस प्रणाली के इष्टतम उपयोग के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, वीएनपी टैग1 एन-टर्मिनस पर स्थित होना चाहिए, इसके बाद प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट और कोई उपयुक्त टैग। एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने से बचना भी महत्वपूर्ण है जो पेप्टिडोग्लाइकन परत को लक्षित करते हैं, जैसे कि एम्पीसिलीन।
विकास की स्थिति के संदर्भ में, समृद्ध मीडिया (जैसे, एलबी या टीबी मीडिया) और एक उच्च सतह क्षेत्र: मात्रा अनुपात पुटिका उत्पादन को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। बाह्य पुटिकाओं के उत्पादन के लिए इष्टतम तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है, लेकिन आमतौर पर रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक स्थितियों पर भी विचार किया जाना चाहिए। कम प्रेरण तापमान के लिए, VNp6 का उपयोग किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, टी 7 प्रमोटर का प्रेरण 20 μg / mL (84 μM) IPTG से अधिक का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जाना चाहिए जब कोशिकाएं 0.8-1.0 के OD600 तक पहुंच जाती हैं। सिस्टम का उपयोग करके व्यक्त प्रोटीन 4 घंटे या रात भर प्रेरण के बाद अधिकतम पुटिका उत्पादन तक पहुंचते हैं।
इस प्रोटोकॉल की सादगी के बावजूद, इसे अनुकूलन की आवश्यकता है। वीएनपी वेरिएंट संलयन, अभिव्यक्ति तापमान और प्रेरण समय अवधि रुचि के प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, मीडिया से बाह्य पुटिकाओं के शुद्धिकरण और बाद की एकाग्रता को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। वर्तमान प्रक्रिया स्केलेबल नहीं है और समय लेने वाली हो सकती है। ये इस पद्धति की सीमाएँ हैं।
वीएनपी तकनीक के पारंपरिक तरीकों पर कई फायदेहैं। यह विविध प्रोटीनों के वेसिकुलर निर्यात की अनुमति देता है, जिसमें आज तक सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया अधिकतम आकार आंतरिक रहने वाले पुटिकाओं के लिए 175 केडीए और निर्यात किए जाने वालों के लिए 85 केडीए है। इसके अलावा, यह तकनीक भौतिक गुणों और गतिविधियों की एक श्रृंखला के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन की उपज में काफी वृद्धि कर सकती है। रुचि के प्रोटीन वाले निर्यात किए गए पुटिकाओं को पूर्व-साफ़ मीडिया से सरल निस्पंदन द्वारा अलग किया जा सकता है और बाद में कई महीनों तक बाँझ संस्कृति मीडिया या बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
इस प्रणाली के लिए अनुप्रयोग विविध हैं, खोज विज्ञान से लागू जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा (उदाहरण के लिए, कार्यात्मक चिकित्सीय के उत्पादन के माध्यम से)3। उत्पादन में आसानी, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और उच्च उपज इन क्षेत्रों में और विशेष रूप से उद्योग में सभी आकर्षक गुण हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक विभिन्न ट्विटर उपयोगकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने वीएनपी तकनीक का वर्णन करने वाले पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बारे में सवाल उठाए। चित्रा 1 ए flaticon.com से आइकन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। इस काम को केंट विश्वविद्यालय और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबी / टी 008/768/1 और बीबी / S005544 / 1) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
Filters for microscope | Chroma | ||
FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
Inverted microscope | Olympus | ||
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |