Optimeret produktion og analyse af rekombinante proteinfyldte vesikler fra E. coli

Det bakterielle arbejde, der udføres, følger de lokale, nationale og internationale regler for indeslutning af biosikkerhed, der passer til det særlige biosikkerhedsfareniveau for hver stamme. 1. Valg af forskellige VNps Identificer VNp-sekvenserne.BEMÆRK: For denne undersøgelse er der identificeret tre VNp-sekvenser1 , der resulterer i maksimalt udbytte og vesikulær eksport af de proteiner, der er undersøgt til dato: VNp2, VNp6 og VNp15. Det er i øjeblikket ikke klart, hvorfor visse VNp-varianter fungerer mere effektivt med nogle proteiner end andre; derfor anbefales det, at fusioner genereres mellem et nyt protein af interesse med hver VNp-variant (dvs. VNp2, 6 eller 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEPlasmider, der tillader ekspression af proteinet af interesse med forskellige VNp-aminoterminale fusioner, er blevet gjort kommercielt tilgængelige (se materialetabel). Design en kloningsstrategi for at indsætte genet af interesse i 3′-enden af cDNA-kodningen for VNp i en af disse konstruktioner, eller tilpas et eksisterende plasmid ved at integrere syntetiseret VNp cDNA opstrøms for det første ATG-codon af genet, der koder for proteinet af interesse. Anvend metoderne som beskrevet i1. For giftige proteiner skal du bruge en vektor med en undertrykkelig ekspressionspromotor eller en promotor med minimal uinduceret ekspressionsstøj. Klon VNp-sekvensmærket ved fusionsproteinets aminoterminal. Sørg for, at affinitetsmærkerne, proteasespaltningssekvenserne osv. Og proteinet af interesse er placeret på carboxylsiden af VNp-mærket. Det anbefales at adskille VNp fra downstreampeptidet med en fleksibel linkerregion, såsom to eller tre gentagelser af en -G-G-S-G- polypeptidsekvens (figur 1).BEMÆRK: Brug plasmider med et antibiotikumvalg, der ikke er målrettet peptidoglycan, hvilket svækker celleoverfladen og reducerer vesikeludbyttet. Kanamycin og chloramphenicol (se tabel over materialer) var de foretrukne antibiotika, der blev anvendt til denne undersøgelse. 2. Bakteriel cellekultur og proteininduktion BEMÆRK: Bakteriestammer, der typisk anvendes i denne protokol, er enten Escherichia coli BL21 (DE3) eller W3110. E. coli-celler dyrkes i lysogenisk bouillon (LB) (10 g / L trypton; 10 g / L NaCl; 5 g / L gærekstrakt) eller fantastisk bouillon (TB) (12 g / L trypton; 24 g / L gærekstrakt; 4 ml / L 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, salte autoklaveret separat) medier (se materialetabel). Figur 2 viser eksempler på billeder, der viser hvert trin i proteininduktionen og den efterfølgende isolations- og oprensningsproces. Kultur 5 ml LB startere fra friske bakterielle transformationer ved 37 ° C til mætning og brug dem til at inokulere 25 ml TB i en 500 ml konisk kolbe, alle med passende antibiotikavalg. Forholdet mellem overfladeareal: volumen er en vigtig faktor i optimeringen af dette system. Brug så stor en rumfangskolbe som muligt (f.eks. 5 L kolbe indeholdende 1 liter kultur; til optimeringskørsler skal du bruge 25 ml medier i en 500 ml kolbe). De større rystekolbekulturer inkuberes i en inkubator ved 37 °C under omrystning ved 200 omdr./min. (≥25 mm orbitalkast), indtil en optisk densitetsværdi på 600 nm (OD600) på 0,8-1,0 er nået.BEMÆRK: Vesikulation er optimal, når cellerne dyrkes ved 37 °C. Nogle rekombinante proteiner kræver imidlertid ekspression ved lavere temperaturer. Hvis dette er tilfældet for det relevante protein, skal VNp6-mærket anvendes, da dette muliggør eksport af vesikel med højt udbytte ved temperaturer ned til 25 °C. For at inducere rekombinant proteinekspression fra T7-promotoren tilsættes isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på op til 20 μg/ml (84 μM) (se materialetabel). Induktionen af rekombinant proteinekspression skal ske i den sene log-fase (dvs. typisk OD600 på 0,8-1,0) til fremstilling af vesikler.BEMÆRK: Længden af induktionsperioden kan variere mellem proteiner, hvor nogle når maksimal produktion ved 4 timer og andre natten over (18 timer). Til dato er der opnået maksimal vesikeleksport i kulturer natten over. 3. Rekombinant vesikelisolering Pellet cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g (4 °C) i 20 min. For at sterilisere vesikelholdige medier til langtidsopbevaring skal de ryddede kulturmedier føres gennem et sterilt og vaskemiddelfrit 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter (se materialetabel).BEMÆRK: For at teste udelukkelsen af levedygtige celler fra det vesikelholdige filtrat, plades på LB-agar og inkuberes natten over ved 37 °C. For at koncentrere vesikler i et mindre volumen føres det sterile vesikelholdige medie gennem et sterilt og vaskemiddelfrit 0,1 μm blandet celluloseesterfilter (MCE) (se materialetabel). Vask forsigtigt membranen med 0,5-1 ml steril PBS ved hjælp af en celleskraber eller plastspreder for forsigtigt at fjerne vesikler fra membranen. Overfør til et frisk mikrofugerør.BEMÆRK: Renset vesikler kan opbevares i sterile medier eller fosfatbufret saltvand (PBS) ved 4 °C. Der er eksempler på rekombinante proteiner opbevaret i disse vesikler i 6 måneder på denne måde uden tab af enzymatisk aktivitet. 4. Opløseligt proteinfrigivelse fra isolerede vesikler Når proteinholdige vesikler er blevet isoleret i det sterile medie / buffer, udsættes vesikulære lipidmembraner for sonikering ved hjælp af en passende tidsplan for apparatet (f.eks. 6x 20 s tænd og sluk-cyklusser) og centrifuger ved 39.000 x g (4 ° C) i 20 minutter for at fjerne vesikelaffald.BEMÆRK: Osmotisk chok eller behandling med vaskemiddel kan bruges som et alternativ til at bryde vesiklerne op, men der skal tages hensyn til indvirkningen på proteinfunktionalitet og/eller downstream-anvendelse. Hvis VNp-fusion forbliver cytosolisk og ikke frigives i medierne, skal proteinet isoleres ved hjælp af standardprotokoller (f.eks. Resuspender cellepillerne i 5 ml af en passende ekstraktionsbuffer (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikere og fjerne celleaffaldet ved centrifugering). 5. Bestemmelse af proteinkoncentration Bestem koncentrationen af proteiner ved geldensitometrianalyse af tredobbelte prøver1. Kør sammen med bovin serumalbumin (BSA) belastningsstandarder på coomassie-farvede natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler. Scan og analyser gelerne ved hjælp af passende software (f.eks. Billede J; se materialetabel). 6. Visualisering af vesikeldannelse og isolerede vesikler ved fluorescensmikroskopi BEMÆRK: Hvis cellerne indeholder fluorescerende mærkede VNp-fusions- eller membranmarkører, kan levende cellebilleddannelse bruges til at følge vesikeldannelse. Alternativt kan fluorescerende lipidfarvestoffer bruges til at visualisere vesikler for at bekræfte produktion og oprensning. Celle monteringInducer VNp-fusionsudtryk i flere timer, før du monterer på dæksedlen. Agarosepudemetode (figur 3A-C): pipetter cellerne på en tynd (<1 mm), cirkulær LB-agarose (2%) pude, der har fået lov til at danne sig og sætte sig på et rent glasglas. Lad cellerne sætte sig og ligevægte, og placer et 50 mm x 25 mm dæksel på puden og cellerne. Hold dækselen på plads med afstandsstykker og tape. Polyethyleneimin (PEI) metode (figur 3D-F): Spred 20 μL 0,05% PEI (i dH2O) på en dæksel med en pipettespids og lad den binde til glas i 3-5 minutter uden at lade tørre. Tilsæt 50 μL cellekultur og lad den stå i 5-10 minutter for at sikre, at bakterier har forbundet sig med den PEI-belagte overflade4. Vask dækslet med 100 μL medie, før du sætter det på diaset, og hold det på plads med afstandsstykker og tape. Montering af vesiklerPipette rensede vesikler på en tynd (<1 mm), cirkulær LB-agarose (2%) pude, der har fået lov til at danne sig og sætte sig på et rent glasglas. Når væsken er tørret, anbringes et 50 mm x 25 mm dæksel på puden og vesiklerne. Hold dækselen på plads med afstandsstykker og tape. Det fluorescerende lipidfarvestof FM4-64 er i stand til at plette membraner5 og kan derfor bruges til at visualisere vesikler. Der tilsættes FM4-64 (se materialetabellen) til rensede vesikler i en slutkoncentration på 2 μM (fra en 2 mM stamme opløst i dimethylsulfoxid [DMSO]) og billede efter 10 minutters inkubation. Dette er især nyttigt til identifikation af vesikler, der indeholder ikke-fluorescerende mærkede laster5. Skyl dæksedlerne med det samme medie, der bruges til at dyrke de observerede celler.BEMÆRK: Nogle komplekse medier (f.eks. TB) kan udvise autofluorescens, hvilket kan resultere i overskydende baggrundssignal. Billeddannelse af vesiklerBEMÆRK: Eksempler på mikroskopibilleder af VNp rekombinante vesikler kan ses i figur 4.Monter objektglasset på et omvendt mikroskop (se materialetabellen) ved hjælp af et olienedsænkningsmål, og lad det stå i 2-3 minutter, så prøven kan bundfælde sig og temperaturen ekvilibreres.BEMÆRK: Al levende cellebilleddannelse for hver prøve skal udfyldes inden for 30 minutter efter montering af celler på dæksedler for at minimere virkningen af fototoksicitet og anaerob stress. Af denne grund foretrækkes enkeltplanbilleder frem for z-stakke. Brug passende lyskilder (f.eks. lysemitterende diode [LED] eller halogenpære; se materialetabel) og filterkombinationer til det eller de fluorescerende proteiner/farvestoffer, der anvendes6. Brug en linse med høj forstørrelse (dvs. 100x eller 150x) og høj numerisk blænde (dvs. NA ≥1.4) til billeddannelse af mikrobielle celler og vesikler. Bestem den minimale lysintensitet, der kræves for at visualisere fluorescenssignaler fra celler og / eller vesikler. Dette kan kræve en vis justering af eksponerings- og forstærkningsindstillingerne for det anvendte kamera.BEMÆRK: Typiske eksponeringstider fra nuværende CMOS-kameraer (complementary metal-oxide semiconductor) varierer mellem 50-200 ms afhængigt af billeddannelsessystemet. Til enkeltbilleder skal du bruge tre-billedgennemsnit for at reducere hardwareafhængig tilfældig baggrundsstøj. For time-lapse-billeddannelse skal der gå 3-5 minutter mellem de enkelte billeder.BEMÆRK: Afhængigt af mikroskopopsætningen skal fokus muligvis justeres intermitterende gennem længere time-lapse-eksperimenter.