Die Ex vivo Präparation eines Rückenmarksschnitts für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in Motoneuronen während der Rückenmarkstimulation
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine Patch-Clamp verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf die Rückenmarkstimulation (SCS) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit zu verbessern.
Abstract
Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Da die Motoneuronen die letzte Einheit sind, die sensomotorisches Verhalten ausführt, kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Reaktionen von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch noch einige komplexe Schwierigkeiten, um dieses Ziel zu erreichen, einschließlich der Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, der schnellen Trennung des Rückenmarks von der knöchernen Struktur und der Verwendung des SCS zur erfolgreichen Induktion von Aktionspotenzialen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das Patch-Clamp verwendet, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu untersuchen, was Forschern helfen kann, ihre Fähigkeiten bei der Trennung des Rückenmarks zu verbessern und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zelle aufrechtzuerhalten, um den elektrischen Mechanismus von SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.
Introduction
Die Rückenmarkstimulation (SCS) kann die Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung effektiv wiederherstellen. Andreas Rowald et al. berichteten, dass SCS die Funktion des Bewegungsapparates und des Rumpfes der unteren Gliedmaßen innerhalb eines einzigen Tages ermöglicht1. Die Erforschung des biologischen Mechanismus von SCS für die Erholung des Bewegungsapparates ist ein kritisches Forschungsfeld für die Entwicklung einer präziseren SCS-Strategie. Das Team um Grégoire Courtine zeigte beispielsweise, dass exzitatorische Vsx2-Interneuronen und Hoxa10-Neuronen im Rückenmark die Schlüsselneuronen für die Reaktion auf SCS sind, und dass eine zellspezifische Neuromodulation möglich ist, um die Gehfähigkeit der Ratte nach einer Rückenmarksverletzung2 wiederherzustellen. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die sich auf den elektrischen Mechanismus von SCS auf Einzelzellebene konzentrieren. Obwohl bekannt ist, dass der überschwellige Gleichstromreiz die Aktionspotentiale (APs) im klassischen Tintenfischexperiment 3,4,5 hervorrufen kann, ist noch unklar, wie sich die gepulste elektrische Wechselstimulation, wie z.B. SCS, auf die motorische Signalerzeugung auswirkt.
Angesichts der Komplexität intraspinaler neuronaler Schaltkreise ist eine geeignete Selektion für die Zellpopulation wichtig, um den elektrischen Mechanismus der SCS zu untersuchen. Obwohl SCS die motorische Funktion durch Aktivierung des propriozeptiven Pfades6 wiederherstellt, sind die Motoneuronen die letzte Einheit, die den motorischen Befehl ausführt, der von der Integration des afferenten Eingangs7 der Propriozeptionsinformation abgeleitet wird. Daher kann uns die direkte Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Motoneuronen mit SCS helfen, die zugrunde liegende Logik der spinalen motorischen Modulation zu verstehen.
Wie wir wissen, ist die Patch-Clamp-Methode die goldene Standardmethode für zellulär elektrophysiologische Aufzeichnungen mit extrem hoher raumzeitlicher Auflösung8. Daher beschreibt diese Studie eine Methode, bei der eine Patch-Klemme verwendet wird, um die elektrischen Reaktionen von Motoneuronen auf SCS zu untersuchen. Im Vergleich zur Gehirn-Patch-Klemme9 ist die Rückenmark-Patch-Klemme aus folgenden Gründen schwieriger: (1) Das Rückenmark wird durch den Wirbelkanal mit winzigem Volumen geschützt, was eine sehr feine Mikromanipulation und eine rigorose eiskalte Wartung erfordert, um eine bessere Zelllebensfähigkeit zu erhalten. (2) Da das Rückenmark zu dünn ist, um auf der Schneideschale befestigt zu werden, sollte es in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt getaucht und nach dem Erstarren gekürzt werden.
Daher liefert diese Methode technische Details bei der Dissektion des Rückenmarks und der gleichzeitigen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, um den elektrischen Mechanismus der SCS auf Motoneuronen reibungslos zu untersuchen und unnötige Versuche und Fehler zu vermeiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die durch SCS modulierten Bewegungsinformationen werden schließlich zu den Motoneuronen konvergiert. Daher könnte die Verwendung der Motoneuronen als Forschungsziel das Studiendesign vereinfachen und den Neuromodulationsmechanismus des SCS direkter aufdecken. Um gleichzeitig verschiedene Reizeigenschaften und zelluläre Reaktionen zu erfassen, ist eine Patch-Clamp eine gute Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften auf Einzelzellebene zu untersuchen. Es gibt jedoch immer noch einige Schwierigkeiten, einschli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 und 82301657) und dem China Postdoctoral Science Fund (2022M711833) finanziert.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
Riferimenti
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