통제 된 조건에서 양배추 흰 나비 (Pieris rapae) 키우기 : 중금속 내성 사례 연구

이 연구는 USDA APHIS 허가 P526P-13-02979에 따라 수행되었습니다. 1. 실험용 나비 수집 공중 방충망으로 성인 암컷 나비를 잡으십시오. 양배추 흰자는 일반적으로 과즙 식물과 숙주 식물(Brassicaceae과)이 존재하는 개방적이고 교란된 서식지에서 발견됩니다.해가 뜨고 온도가 따뜻할 때 검색하십시오. 암컷을 표적으로 삼으려면 천천히 펄럭이고 땅에 가까이 다가가 식물에 착지하여 앞발로 잎을 “드럼”(맛보기)하는 개체를 찾으십시오. 새장에 암컷을 세워 알을 수확하십시오.참고: 현장에서 채집한 암컷은 평균적으로 한두 마리의 수컷과 교미를 한다12, 포획 직후 수정란을 낳기 시작한다. 야생에서 잡힌 암컷은 산란과 짝짓기를 위해 자연 채광이 필요하므로 새장을 온실이나 창턱에 두십시오. 알을 수확하기 위해 숙주 식물을 가진 암컷을 기르십시오.참고: 암컷은 녹색 양배추, 무, 케일, 콜라드, 애기장대를 포함한 다양한 숙주 식물을 수용하지만 식물이 살충제로 처리되지 않았는지 확인합니다.꽃 물관에 있는 케일 줄기와 같이 잎 압력을 유지하기 위해 화분이나 물이 담긴 용기에 숙주 식물을 제시합니다. 연구자가 알을 채취하여 식단으로 직접 옮기려면 먼저 고무 밴드를 사용하여 숙주 식물 잎을 플라스틱 물 컵 상단에 부착한 다음 가장자리 주위에 파라필름 조각을 늘립니다. 예를 들어 케이지에 상대 습도를 높게 유지하기 위한 무언가가 포함되어 있는지 확인하십시오.ample, 특히 건조한 조건에서 화분에 매일 물을 주거나 수건을 적시는 것과 같이. 화분에 심은 식물이 새장에 물을 주면 나비가 고인 물에 갇힐 수 있으므로 화분 아래에 수건이 있는지 확인하십시오. 나비에게 노란색 스폰지에 제시된 10 % 희석 된 꿀 물 용액을 먹이십시오.이 용액은 나비가 특히 숙련 된 개인과 함께 수용하는 경우 빠르게 사용법을 배웁니다.나비가 스폰지에서 먹이를 먹도록 장려하기 위해, 특히 물병을 살짝 뿌린 후에는 나비를 피더에 직접 올려 놓으십시오. 피더를 설치하려면 먼저 노란색 또는 주황색 스폰지를 철저히 헹구고 60mm 플라스틱 페트리 접시에 맞는 작은 사각형으로 자릅니다. 매일 피더를 교체하고 순한 표백제 용액으로 스폰지를 청소한 다음 곰팡이가 자라지 않도록 철저히 헹굽니다. 2. 인공 다이어트 만들기 먼저, 표 1의 레시피 또는 기타 관련 소스를 사용하여 실험에 대한 관련 레시피를 결정합니다. 초점 종이나 실험에 따라 필요한 수정을 가하십시오. 재료의 무게를 잴 때 따를 레시피를 인쇄하십시오. 한천을 제외한 모든 건조 재료를 하나의 용기에 담습니다. 여러 재료가 4°C에서 보관된다는 점에 유의하여 재료를 각각의 보관 위치에 다시 넣었는지 확인합니다. 미리 계량된 건조 재료 혼합물을 아마씨 오일 5mL와 함께 블렌더에 넣습니다. 각 다이어트 배치에 대해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.15 g의 미세 메쉬 한천과 400 mL의 증류수를 최소 1 L 크기의 비이커에 넣고 섞는다. 한천이 끓을 때까지 전자레인지에 돌리고 혼합물 전체에 미세한 거품이 생기고 혼합물이 끓는 것을 방지하기 위해 30-60초마다 저어줍니다. 이 뜨거운 한천 혼합물에 400mL의 수도꼭지 온도 증류수를 첨가하여 비타민 혼합물이 열에 민감하므로 건조 성분과 혼합할 수 있는 적절한 온도로 만듭니다. 한천 혼합물을 블렌더에 넣고 필요한 경우 블렌더의 가장자리를 긁어 완전히 혼합합니다. 한천이 가열되는 동안 가장자리가 닿도록 카운터에 최소 70개의 4온스 다이어트 컵을 놓습니다. 다이어트를 완전히 섞은 후 블렌더의 혼합물을 다이어트 컵에 붓고 다이어트가 각 컵의 바닥을 덮도록 합니다. 다이어트가 식은 후 컵에 뚜껑을 덮고 다이어트 컵에 다이어트 유형을 라벨을 붙이고 트레이에 쌓아 놓고 사용할 때까지 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다. 3. 인공 식단에 대한 전이 및 양육 하우스 호스트 식물은 24 ° C 기후 챔버에서 메쉬 커버가있는 30 온스 델리 컵에 나비 알을 담근다. 1 주일 후, 컵을 확인하여 유충이 부화하고 늦은 첫 번째 또는 두 번째 instar 단계에서 인공 식단으로 옮기기에 좋은시기입니다. 유충을 페인트 브러시로 인공 식단으로 옮기고 표백제 스프레이로 소독하고 유충 용기 사이에 물을 헹굽니다. 3마리의 유충을 각 4온스 컵에 옮깁니다. 인공 식단은 에너지 밀도가 높고 고밀도의 유충을 지원할 수 있지만 유충 밀도가 높은 컵에 질병과 곰팡이가 퍼질 수 있으므로 유충을 컵에 포장하지 마십시오. 컵을 옆면의 플라스틱 통에 넣어 프라스가 컵 바닥으로 떨어지고 식단에서 멀어지도록 하여 곰팡이와 질병 위험을 줄입니다.다이어트 컵은 낮거나 중간 정도의 조명 수준으로 제어된 온도 조건에 보관하십시오. 투명한 컵 뚜껑을 통해 엿보면서 1-2일마다 컵에 곰팡이와 질병이 있는지 모니터링하십시오. 곰팡이나 질병이 있는 컵은 다른 컵으로 퍼지는 것을 방지하기 위해 격리하거나 냉동할 수 있습니다. 4. 성인 출현 및 취급 유충이 번데기를 타고 다이어트 컵에 나오도록 하십시오. 성충이 나오면 표시를 위해 날개를 제거하기 전에 날개가 굳을 때까지 몇 시간을 주십시오. 날개를 부드럽게 잡고 깨끗한 손으로 컵에서 성인 나비를 제거하고 네 날개를 모두 몸에 더 가깝게 잡는 것이 더 안정적인 그립이라는 점에 유의하십시오. 나비를 표시하려면 마른 사람의 머리와 가슴을 잡고 끝이 가는 샤피를 사용하여 뒷날개에 숫자를 가볍게 표시합니다.날개 표시와 생식기의 조합을 사용하는 성별 개인; 암컷은 일반적으로 등쪽 앞날개에 두 개의 검은 반점이 있고 더 어둡고 더 노란 뒷날개가 있는 반면, 수컷은 일반적으로 더 밝은 흰색 배경에 등쪽 앞날개에 작은 검은 반점이 하나 있습니다54. 이 착색이 개인 및 계절적 변화를 나타낸다는 점을 감안할 때, 복부 특성을 사용하여 성별을 확인하십시오 – 남성은 복부의 말단부에 두 개의 걸쇠가 있고 일반적으로 복부가 더 좁은 반면 여성은 단일 생식기 개구부를 가지고 있습니다. 한 손으로 봉투를 열고 나비의 머리와 가슴을 잡고 봉투에 밀어 넣고 다른 손으로 봉투를 통해 날개를 잡아 성인을 왁스 글라신지 봉투로 옮깁니다.네 개의 날개가 모두 봉투 내에서 정상적으로 닫혀 있는지 확인하십시오. 실험 전 최대 5주일 동안 나비를 추운 조건(6-1°C)에 유지하되 냉장고에서 꺼낼 때 적응하는 데 최소 1일이 걸립니다. 5. 성과 측정 죽은 개체의 날개 특성을 측정하려면 한 손으로 흉부를 잡고 집게를 사용하여 바닥에서 각 날개를 제거하여 나비의 날개를 제거합니다. 날개를 라이트박스에 평평하게 놓고 나중에 측정할 수 있도록 사진을 찍습니다. 번식력을 추정하려면 성충을 짝짓기 케이지에 수용하여 수컷의 생식 성숙에 최소 1일, 짝짓기에 1일을 허용합니다. 해부를 통해 알 수를 위해 정해진 시점에 암컷을 희생시키거나 숙주 식물에서 매일 알을 수집합니다. 달걀 부하를 추정하려면 암컷의 복부를 제거하고 1x PBS 완충액에 넣고 복부 쪽을 따라 슬릿을 자릅니다.집게를 사용하여 큐티클에서 내장을 분리한 다음 장, 기관 및 기타 복부 내용물에서 난소를 당겨냅니다. 두 개의 난소 각각에 있는 4개의 말린 난소를 펴고 성숙한 난자, 노른자 및 껍질을 벗긴 난자가 미성숙 난포로 전환되는 위치를 확인합니다. 카운터를 사용하여 일반적으로 0-200개의 알 범위의 총 성숙한 알을 집계하는 데 도움이 됩니다. 해부된 암컷의 짝짓기 상태를 확인하려면 부르사 코풀라트릭스를 열고 그 안에 있는 정자를 분리합니다. 정자는 소화될 때 일반적으로 “꼬리”가 생기고 서로 중첩됩니다. 6. 사례 연구 참고: 2014년 야생에서 성체 암컷 양배추 흰나비를 채취하여 실험 개체군을 찾았습니다. 성인 여성은 캘리포니아 데이비스 근처에서 유래했습니다(N = 8명의 창립 여성). 나비 수용온실의 자연 채광 아래 “BugDorm”메쉬 케이지 (61cm x 61cm x 61cm)에 암컷을 수용하십시오. 산란을 위해 숙주 식물 양배추 (Brassica oleracea)의 유기농 잎을 제공하십시오. 케이지의 습도를 유지하려면 매일 물을 주는 작은 화분(코스모스)을 각 케이지 안의 수건 위에 올려 놓으십시오. 새 달걀이 든 잎을 뚜껑에 구멍이 있는 473mL 플라스틱 컵에 옮겨 매일 달걀을 모으고 기후 챔버에 넣습니다. 나비에게 매일 바뀌는 작은 페트리 접시에 담긴 노란색 스폰지를 통해 접근할 수 있는 10% 꿀 물 용액(유기농 꿀을 증류수로 희석하여 만든)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하십시오. 인공 다이어트 준비이전에 개발 된 나비목 식단의 변형을 사용하여 양배추 흰 유충을위한 인공 식단을 준비하십시오4. 한 배치의 식단에는 밀 배아 50g, 카제인 27g, 셀룰로오스 10g, 자당 24g, 양배추 가루 15g, 웨슨 소금 믹스 9g, 토룰라 효모 12g, 콜레스테롤 3.6g, Vanderzant 비타민 믹스 10.5g, 메틸 파라벤 1.1g, 소르빈산 1.5g, 아스코르브산 3g, 스트렙토마이신 0.175g( 재료 표 참조). 여러 다이어트 배치(표 1)를 위해 건조 성분을 미리 칭량하고 금속 용액과 혼합하기 위해 별도의 배치로 세분화하기 전에 식단 유형 전반에 걸쳐 균질성을 높이기 위해 철저히 혼합합니다. 아마인유와 해당 금속 혼합물이 있는 블렌더에 마른 재료를 넣습니다.참고: 아마인유는 과거 곤충 사료 공급업체에서 판매한 대로 본 실험에 사용되었습니다. 이제 유기농 아마씨 오일은 독점적으로 사용되며 동일한 식물에서 만들어 지지만 아마씨 오일의 상업적 공급 업체로서 첨가제를 함유 할 가능성이 적습니다. 준비된 식단을 118mL(4oz) 플라스틱 델리 컵에 붓습니다. 수용성 금속염을 사용하여 인공 식단에 초점 금속을 추가하십시오. 식물의 금속 함량(예: 니켈 축적 55,56,57 또는 식물의 길가 오염 58,59,60)과 다른 나비목 49,50,51의 금속 내성에 대한 사전 관찰을 기반으로 금속 농도를 목표로 합니다. 인공 식단에 추가하기 위해 해당 양을 복용하기 전에 500-1,000mL의 증류수에 금속염을 녹입니다. 예를 들어, 100ppm 니켈 다이어트를 만들기 위해 블렌딩하기 전에 인공 다이어트에 1M NiCl2 용액 317.6mL를 추가하여 최종 다이어트 농도가 100mg/g Ni 건조 중량(약 53mg/g 습윤 중량)이 되도록 합니다. 이 양은 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법을 기반으로 한 109.6ppm의 평균 측정 농도로 변환됩니다(표 2).참고: 금속 수준은 미네소타 대학의 Research Analytical Labs에서 6개의 샘플로 추정했습니다. 정비숙주 식물에서 수확한 알을 기후 챔버에서 23°C에서 14:10 광주기로 7일 동안 유지합니다. 그 후, 초기 두 번째 instar 애벌레를 인공 식단으로 옮깁니다. 옮길 때, 주어진 식물의 유충을 4가지 식단 유형에 걸쳐 균등하게 나누어 유충 배치를 식단 유형과 혼동하지 않도록 합니다. 유충(N = 총 346마리)을 118mL 다이어트 컵당 2마리로 옮겨 과밀로 인한 질병 발병률을 줄이고 성충이 결국 둘러쌀 수 있는 충분한 공간을 확보합니다. 양육 컵의 뚜껑에 구멍(뚜껑당 3개)을 뚫습니다. 컵을 신발장 크기의 플라스틱 통에 넣어 사육실의 위치가 체계적으로 영향을 미치지 않도록 다양한 식단이 산재되어 있습니다. 14:10 광주기에 23°C의 기후 챔버에 유충 컵을 보관합니다(습도를 약 50%-60%로 유지하기 위해 챔버 바닥에 물통이 있고 가정용 습도 센서로 모니터링됨). 컵에 곰팡이가 생기면 (이 사례 연구에서는 총 8 개의 컵) 챔버에서 컵을 제거하고 실험에서 해당 개인을 제거하십시오. 유충이 번데기를 타고 사육 컵에서 나오도록 합니다(N = 총 162개).참고: 이 연구의 사육 조건의 경우 난자 채취에서 성충 출현까지의 발달 시간은 평균 약 25-30일(예: 25,28일 범위)이었습니다. 번데기가 성충 출현에 접근함에 따라 매일 컵에 새로 닫힌 개체가 있는지 확인하고 마른 날개를 가진 성충을 제거하십시오. 끝이 가늘고 검은 색 샤피를 사용하여 뒷날개에 해당하는 개인 번호 (애벌레 이동시 할당)로 성인을 표시하십시오. 각 개인의 성별을 결정하고 글라신지 봉투에 번호 및 출현 날짜와 함께 표시하십시오. 성체 나비를 글라신지 봉투에 넣고 추가 처리가 이루어질 때까지 -20°C에서 보관합니다.참고: 신흥 성인의 소수는 비행 및 성인 생존을 방해하는 날개 기형을 보입니다(5%-8%). 이러한 개인은 이러한 실험에 대한 생존 분석에서 제외됩니다. 측정 및 데이터 분석두 번째 instar (애벌레가 식단에 놓였을 때)부터 성인 출현까지의 생존으로 생존을 측정합니다.참고: 본 연구는 다양한 식단에 대한 수행 척도로서 생존 및 발달 시간에 초점을 맞췄습니다. 발달 시간을 식이요법으로의 전환과 기후 챔버에서 성인의 출현 사이의 일수로 측정합니다. 데이터 분석을 위해 금속과 농도 간의 교호작용이 포함된 두 세트의 모형을 실행합니다.참고: 두 상호작용 모두 유의했기 때문에(NS 2,194 = 4.56, NS = 0.01 발달 시간 및 X2 = 12.1, NS = 0.002 생존), 연구는 각 금속에 대한 별도의 분석을 진행했습니다. 생존을 분석하려면 각 금속에 대해 카이제곱 검정을 실행하여 날개가 완전히 손상되지 않은 상태에서 성체까지의 생존에 대한 금속 선량(4가지 범주로 처리됨)의 영향을 검정합니다. 용량의 유의미한 효과가 감지되면 추적 카이제곱을 수행하여 각 수준을 대조군 식단과 비교합니다. 발달 시간(전이 시점부터 성인으로 출현할 때까지)을 분석하기 위해 발달 시기에 대한 성의 영향을 테스트합니다.참고: 이 실험에서 모든 금속에 대해 발달 시간(p > 0.10)에 대한 성별의 영향이 없었기 때문에 모델에서 고려 대상에서 제외했습니다. 각 금속에 대해 별도의 ANOVA를 실행하여 4가지 농도가 현상 시간에 미치는 영향을 테스트합니다. 또한 대조군을 기준으로 각 농도에 대해 t-검정을 실행하여 성능 효과가 나타나는 최소 농도를 확인합니다.참고: 이 연구에서는 모든 분석에 JMP v16을 사용했습니다. 모든 원시 데이터는 Mendeley61에서 사용할 수 있습니다.