Перевязка левого предсердия у эмбриона птицы как модель измененной гемодинамической нагрузки при раннем развитии сосудов
Summary
Здесь мы представляем подробный визуальный протокол выполнения модели перевязки левого предсердия (LAL) у эмбриона птицы. Модель LAL изменяет внутрисердечный поток, который изменяет напряженную нагрузку при сдвиге стенки, имитируя синдром гипоплазии левых отделов сердца. Представлен подход к преодолению трудностей, связанных с этой сложной моделью микрохирургии.
Abstract
Благодаря своей четырехкамерной конфигурации зрелого желудочка, простоте культивирования, доступу к визуализации и эффективности, птичий эмбрион является предпочтительной моделью позвоночных животных для изучения сердечно-сосудистого развития. В исследованиях, направленных на понимание нормального развития и прогноза врожденных пороков сердца, широко используется эта модель. Микроскопические хирургические методы используются для изменения нормальной механической нагрузки в определенный момент времени эмбриона и отслеживания нисходящего молекулярно-генетического каскада. Наиболее распространенными механическими вмешательствами являются перевязка левой вителлиновой вены, конотранкальное бандажирование и перевязка левого предсердия (LAL), модулирующая внутрисосудистое давление и напряжение сдвига стенки из-за кровотока. LAL, особенно если она выполняется в яйцеклетке, является наиболее сложным вмешательством, с очень малым выходом образцов из-за чрезвычайно тонких последовательных микрохирургических операций. Несмотря на высокий риск, in ovo LAL очень ценен с научной точки зрения, поскольку имитирует патогенез синдрома гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО). СГЛОС является клинически значимым сложным врожденным пороком сердца, наблюдаемым у новорожденных. Подробный протокол для in ovo LAL описан в этой статье. Вкратце, оплодотворенные эмбрионы птиц инкубировали при температуре 37,5 °C и постоянной влажности 60%, как правило, до тех пор, пока они не достигали стадий Гамбурга-Гамильтона (HH) со 20 по 21. Скорлупа яиц была вскрыта, а внешняя и внутренняя оболочки удалены. Эмбрион осторожно поворачивали, чтобы обнажить луковицу левого предсердия общего предсердия. Предварительно собранные микроузлы из нейлоновых нитей 10-0 аккуратно располагались и завязывались вокруг почки левого предсердия. Наконец, эмбрион был возвращен в исходное положение, и LAL была завершена. Нормальный желудочек и желудочки с LAL-инструментами продемонстрировали статистически значимые различия в уплотнении тканей. Эффективная генерация моделей LAL будет способствовать исследованиям, посвященным синхронизированным механическим и генетическим манипуляциям во время эмбрионального развития сердечно-сосудистых компонентов. Кроме того, эта модель обеспечит возмущенный клеточный источник для исследований тканевых культур и сосудистой биологии.
Introduction
Врожденные пороки сердца (ВПС) – это структурные нарушения, возникающие из-за аномального эмбрионального развития1. Помимо генетических условий, на патогенез влияет измененная механическая нагрузка 2,3. Синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС), врожденный порок сердца, приводит к недоразвитию желудочка/аорты при рождении4 с высоким уровнем смертности 5,6. Несмотря на недавние успехи в клиническом лечении, динамика роста и развития сосудов при СГЛОС до сих пор неясна7. При нормальном эмбриональном развитии эндокард и миокард левого желудочка (ЛЖ) происходят от предшественников сердца по мере прогрессирования раннего эмбрионального формирования трубки сердца. Сообщается о постепенном наличии трабекуляции миокарда, утолщения слоев и пролиферации кардиомиоцитов2. При СГЛОС наблюдается измененное трабекулярное ремоделирование и уплощение левого желудочка, что в дальнейшем способствует гипоплазии миокарда из-за аномальной миграции кардиомиоцитов 2,8,9,10
Среди широко используемых модельных организмов для изучения развития сердца и понимания гемодинамических условий 11 предпочтение отдается эмбриону птицы из-за его четырехкамерного зрелого сердца и простоты культивирования11,12,13,14. С другой стороны, расширенный доступ к визуализации эмбрионов рыбок данио и трансгенных/нокаутных мышей обеспечивает явные преимущества11,12. На эмбрионе птицы были опробованы различные механические вмешательства, которые изменяют внутримурное давление и напряжение сдвига стенки в развивающихся сердечно-сосудистых компонентах. Эти модели включают лигирование левого вителлина, конотрункальное бандажирование15 и лигирование левого предсердия (LAL)11,12,16. Полученный фенотип, обусловленный измененной механической нагрузкой, можно наблюдать примерно через 24-48 ч после хирургического вмешательства в исследованиях, ориентированных на ранний прогноз11,13. Вмешательство LAL является популярным методом сужения функционального объема левого предсердия (LA) путем наложения шовной петли вокруг атриовентрикулярного отверстия. Кроме того, были выполнены микрохирургические вмешательства, нацеленные на перевязку правого предсердия (RAL)17,18. Точно так же некоторые исследователи нацеливаются на придаток левого предсердия (LAA) с помощью микроклипсов, чтобы уменьшить объем LA19,20. В некоторых исследованиях на атриовентрикулярный узел накладывают хирургическую капроновую нить19,21. Одним из используемых вмешательств является LAL, который может имитировать HLHS, но также является самой сложной моделью для выполнения, с очень малым выходом образцов из-за чрезвычайно тонких микрохирургических операций. В нашей лаборатории LAL проводится in ovo между 20-й и 21-й стадиями по шкале Гамбурга-Гамильтона (HH), до того, как общее предсердие будет полностью септировано 6,14,22,23. Вокруг ЛП накладывается хирургический шов, который изменяет внутрисердечный кровоток. В моделях СГЛОС ЛАЛ наблюдается повышенная жесткость стенок желудочков, измененные углы миоволокон и уменьшение размеров полости ЛЖ14,24.
В этой видеостатье представлен подробный протокол и подход к проведению in ovo LAL. Вкратце, оплодотворенные птичьи эмбрионы были инкубированы для микрохирургии, скорлупа яйца была вскрыта, а внешняя и внутренняя оболочки очищены. Затем эмбрион медленно вращали так, чтобы ЛП была доступна. Нейлоновый хирургический шов 10-0 был наложен на зачаток предсердий, и эмбрион был возвращен в его первоначальную ориентацию, завершив процедуру LAL25. LAL и нормальные желудочки сравнивают на уплотнение тканей и объем желудочков с помощью оптической когерентной томографии и базовой гистологии.
Успешно реализованная модель LAL, описанная здесь, будет способствовать фундаментальным исследованиям, посвященным эмбриональному развитию сердечно-сосудистых компонентов. Эта модель также может быть использована вместе с генетическими манипуляциями и передовыми методами визуализации. Кроме того, острая модель LAL является стабильным источником пораженных сосудистых клеток для экспериментов с тканевыми культурами.
Protocol
Representative Results
Discussion
При СГЛОС кровоток изменяется из-за структурных дефектов, что приводит к аномальной морфологии с левой стороны 4,6. Данная модель представляет собой практическую экспериментальную систему, позволяющую лучше понять прогрессирование СГЛОС и даже имитиров…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность компании Tubitak 2247A за предоставление финансирования. Авторы также выражают благодарность PakTavuk Gıda. A. S., Стамбул, Турция, за обеспечение оплодотворенных яйцеклеток и поддержку сердечно-сосудистых исследований.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
Riferimenti
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
