Inyecciones intracerebroventriculares a mano alzada en ratones
Summary
En este trabajo se describe un método sencillo y rápido para realizar inyecciones intracerebroventriculares en ratones mediante un abordaje a mano alzada (es decir, sin dispositivo estereotáxico).
Abstract
La investigación de los sistemas neuroendocrinos a menudo requiere la administración de fármacos, virus u otros agentes experimentales directamente en el cerebro de los ratones. Una inyección intracerebroventricular (ICV) permite la administración generalizada del agente experimental en todo el cerebro (particularmente en las estructuras cercanas a los ventrículos). Aquí, se describen los métodos para realizar inyecciones de ICV a mano alzada en ratones adultos. Mediante el uso de puntos de referencia visuales y táctiles en las cabezas de los ratones, las inyecciones en los ventrículos laterales se pueden realizar de forma rápida y fiable. Las inyecciones se realizan con una jeringa de vidrio sostenida en la mano del experimentador y colocada a distancias aproximadas de los puntos de referencia. Por lo tanto, esta técnica no requiere un marco estereotáxico. Además, esta técnica solo requiere una breve anestesia con isoflurano, lo que permite la evaluación posterior del comportamiento y/o la fisiología del ratón en ratones despiertos y de comportamiento libre. La inyección de ICV a mano alzada es una herramienta poderosa para la administración eficiente de agentes experimentales en el cerebro de ratones vivos y se puede combinar con otras técnicas como la toma frecuente de muestras de sangre, la manipulación de circuitos neuronales o el registro in vivo para investigar procesos neuroendocrinos.
Introduction
La administración de agentes experimentales, como fármacos1, virus2 o células3, al cerebro suele ser necesaria para la investigación neuroendocrina. Si el agente no cruza fácilmente la barrera hematoencefálica o el objetivo experimental es probar específicamente los efectos centrales del agente, es importante tener un método confiable para administrar inyecciones en el cerebro. Además, la inyección en el espacio intracerebroventricular (VCI) brinda la oportunidad de distribuir el agente ampliamente en el cerebro y proporciona una gran área diana, lo que aumenta la probabilidad de éxito de la inyección2.
Un método común para hacer inyecciones de ICV implica la colocación de una cánula permanente permanente. En este enfoque, es necesario un marco estereotáxico para colocar la cánula disponible comercialmente o hecha a medida, ya que la cánula se pega o cementa en su lugar. A menudo, en el momento de la recuperación, se administra una dosis suprafisiológica de angiotensina II a través de la cánula, y si se observa inmediatamente el comportamiento de la bebida, entonces la cánula se considera correctamente colocada4. Este enfoque tiene muchas ventajas, incluida la capacidad de realizar una infusión a largo plazo y la capacidad de inyectar al mismo animal varias veces; además, si se emplea angiotensina II, se puede confirmar la correcta colocación antes de la administración de compuestos experimentales. Sin embargo, existen algunas limitaciones para colocar una cánula permanente, incluyendo el requisito de un equipo costoso (marco estereotáxico), la posibilidad de daño a la cánula después de la colocación (p. ej., los ratones pueden masticar la cánula de un compañero de jaula) y la posibilidad de infecciones alrededor de la cánula permanente. Las inyecciones únicas de ICV se pueden realizar con el uso de un marco estereotáxico3, que, aunque efectivo, requiere una exposición sustancial a la anestesia y, por lo tanto, puede oscurecer algunos efectos fisiológicos y conductuales agudos del tratamiento. Además, la colocación de ratones en un marco estereotáxico requiere un entrenamiento sustancial para lograr una colocación estable y evitar la ruptura de los canales auditivos.
Aquí, se describe un método establecido para hacer inyecciones a mano alzada en ratones. Este método se basa en informes anteriores 5,6. Las ventajas de esta técnica son que es sencilla, rápida y no requiere de un equipo especializado como un marco estereotáxico. Como se describe a continuación, este procedimiento consiste en manipular una jeringa de vidrio en relación con los puntos de referencia en la cabeza del ratón para realizar las inyecciones, lo que se puede hacer rápidamente y, por lo tanto, requiere solo unos minutos de anestesia con gas el día experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se describe un medio simple y efectivo para hacer inyecciones de ICV en ratones. Dado que esta técnica no requiere un marco estereotáxico, este enfoque para la administración central de fármacos y agentes experimentales es accesible para más investigadores. Además, este enfoque tiene un rendimiento relativamente alto, ya que el procedimiento de preparación e inyección se puede realizar rápidamente.
Dado que este procedimiento requiere la manipulación manual de agujas y una jer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Dra. Kellie Breen Church, al Sr. Michael Kreisman y a la Sra. Jessica Jang por sus contribuciones a la recopilación de los datos que se muestran en los resultados representativos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Riferimenti
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