Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi
Summary
Qui viene descritto un approccio semplice e rapido per l’esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera (cioè senza un dispositivo stereotassico).
Abstract
Lo studio dei sistemi neuroendocrini richiede spesso la somministrazione di farmaci, virus o altri agenti sperimentali direttamente nel cervello dei topi. Un’iniezione intracerebroventricolare (ICV) consente la somministrazione diffusa dell’agente sperimentale in tutto il cervello (in particolare nelle strutture vicino ai ventricoli). Qui vengono descritti i metodi per effettuare iniezioni ICV a mano libera in topi adulti. Utilizzando punti di riferimento visivi e tattili sulle teste dei topi, le iniezioni nei ventricoli laterali possono essere effettuate in modo rapido e affidabile. Le iniezioni vengono effettuate con una siringa di vetro tenuta in mano dallo sperimentatore e posta a distanze approssimative dai punti di riferimento. Pertanto, questa tecnica non richiede un frame stereotassico. Inoltre, questa tecnica richiede solo una breve anestesia con isoflurano, che consente la successiva valutazione del comportamento e/o della fisiologia del topo in topi svegli e che si comportano liberamente. L’iniezione ICV a mano libera è un potente strumento per la somministrazione efficiente di agenti sperimentali nel cervello di topi viventi e può essere combinata con altre tecniche come il prelievo frequente di sangue, la manipolazione dei circuiti neurali o la registrazione in vivo per studiare i processi neuroendocrini.
Introduction
La somministrazione di agenti sperimentali, come i farmaci1, i virus2 o le cellule3, al cervello è spesso necessaria per la ricerca neuroendocrina. Se l’agente non attraversa facilmente la barriera emato-encefalica o l’obiettivo sperimentale è quello di testare in modo specifico gli effetti centrali dell’agente, è importante disporre di un metodo affidabile per somministrare iniezioni nel cervello. Inoltre, l’iniezione nello spazio intracerebroventricolare (ICV) offre l’opportunità di distribuire ampiamente l’agente nel cervello e fornisce un’ampia area bersaglio, aumentando così la probabilità di successo dell’iniezione2.
Un metodo comune per effettuare iniezioni di ICV prevede il posizionamento di una cannula permanente a permanenza. In questo approccio, è necessario un telaio stereotassico per posizionare la cannula disponibile in commercio o su misura, poiché la cannula viene incollata o cementata in posizione. Spesso, al momento del recupero, viene somministrata una dose sovrafisiologica di angiotensina II attraverso la cannula e, se si osserva immediatamente il comportamento del bere, la cannula viene considerata posizionata correttamente4. Questo approccio presenta molti vantaggi, tra cui la possibilità di eseguire un’infusione a lungo termine e la possibilità di iniettare più volte lo stesso animale; inoltre, se viene impiegata l’angiotensina II, il corretto posizionamento può essere confermato prima della somministrazione di composti sperimentali. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni al posizionamento di una cannula permanente, tra cui la necessità di attrezzature costose (telaio stereotassico), la possibilità di danni alla cannula dopo il posizionamento (ad esempio, i topi possono masticare la cannula di un compagno di gabbia) e la possibilità di infezioni intorno alla cannula permanente. Le iniezioni singole di ICV possono essere effettuate con l’uso di un framestereotassico 3, che, sebbene efficace, richiede una sostanziale esposizione all’anestesia e, quindi, può oscurare alcuni effetti fisiologici e comportamentali acuti del trattamento. Inoltre, il posizionamento dei topi in un telaio stereotassico richiede una formazione sostanziale per ottenere un posizionamento stabile e prevenire la rottura dei condotti uditivi.
Qui viene descritto un metodo consolidato per effettuare iniezioni a mano libera nei topi. Questo metodo si basa sulle precedenti relazioni 5,6. I vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, rapida e non richiede attrezzature specializzate come un telaio stereotassico. Come descritto di seguito, questa procedura prevede la manipolazione di una siringa di vetro rispetto ai punti di riferimento sulla testa del topo per effettuare le iniezioni, che possono essere eseguite rapidamente e, quindi, richiedono solo pochi minuti di anestesia gassosa il giorno dell’esperimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene descritto un mezzo semplice ed efficace per effettuare iniezioni di ICV nei topi. Poiché questa tecnica non richiede una struttura stereotassica, questo approccio per la somministrazione centralizzata di farmaci e agenti sperimentali è accessibile a un maggior numero di ricercatori. Inoltre, questo approccio ha una produttività relativamente elevata poiché la procedura di preparazione e iniezione può essere eseguita rapidamente.
Poiché questa procedura richiede la manipolazione…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Kellie Breen Church, il Sig. Michael Kreisman e la Sig.ra Jessica Jang per il loro contributo alla raccolta dei dati mostrati nei risultati rappresentativi. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
Riferimenti
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
