플라즈몬 DNA 종이접기 나노안테나로 구현되는 단일 분자 표면 강화 라만 산란 측정

1. DNA 종이 접기 포크 어셈블리 하나의 냄비에 DNA 종이 접기 구조를 자체 조립합니다. 먼저, 15 mMMgCl2 완충액으로 보충된 1x TAE (트리스[히드록시메틸]아미노메탄[트리스], 아세트산, 에틸렌디아민 아세트산[EDTA])에 2.5 nM 원형 스캐폴드 가닥 M13mp18 (7,249 뉴클레오티드, 재료 표 참조) 및 100 nM의 201 짧은 올리고뉴클레오티드 (표 1)를 추가한다. 그런 다음 초순수를 사용하여 총 부피를 100μL로 조정합니다. 용액을 열순환기에서 온도 구배에 의해 연속적으로 어닐링하고, 먼저 80°C로 급속히 가열한 다음, 1°C/12분에서 80°C에서 20°C로 냉각한 다음, 1°C/6분에서 20°C에서 16°C로 냉각한 다음, 16°C에서 8°C로 급속히 냉각합니다. 100kDa 분자량 차단(MWCO) Amicon 필터( 재료 표 참조)를 사용하여 과도한 스테이플에서 혼합물을 정제합니다.DNA 종이접기 용액 100μL와 초순수 400μL를 Amicon 필터에 넣은 다음 실온(RT)에서 6,000x g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 필터를 제거하고 튜브를 뒤집어 싱크대의 세척액을 제거하여 여과액을 버린 다음 필터에 초순수 400μL를 넣고 다시 원심분리합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 정제된 나노구조 용액을 수집하려면 제조업체의 지침에 따라 새 튜브와 원심분리기(1,000 x g, 2분, RT)에서 필터를 거꾸로 뒤집습니다( 재료 표 참조). 이 용액은 8°C의 냉장고에 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.참고: 물은 안정성을 감소시키고 얻은 DNA 종이접기 포크의 농도를 낮추기 때문에 Amicon 필터 정제 단계를 위해 초순수 대신 1x TAE 완충액 또는 15mM MgCl2 완충액으로 보충된 1x TAE를 사용하십시오. 단일 염료 분자 측정을 위해 DNA 스테이플 가닥 혼합물은 5′ 말단에 TAMRA 염료를 포함하는 변형된 가닥 혼합물로 대체됩니다. 이 변형된 가닥은 나노포크 브리지의 중간에 있습니다(표 2). 2. 금 나노 입자 (AuNP) 코팅 참고: Liu et al.23 프로토콜의 수정된 버전이 AuNP를 코팅하는 데 사용되었으며 코팅 공정에는 AuNP-DNA 용액을 동결하는 작업이 포함되었습니다. 원심분리(3,500 x g, 5분, RT)를 400 μL의 60 nm 직경 AuNP 용액(상업적으로 입수됨; 표 of Materials를 참조)하고, 피펫을 사용하여, 상청액을 제거하였다. 그런 다음 펠릿을 초순수 25μL에 재용해합니다. AuNPs의 최종 농도는 ~0.3 nM이다. 1 μL의 100 mM 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 용액을 4 μL의 티올-변형된 DNA(제조업체에서 제공한 100 μM, 재료 표 참조)에 추가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 5 μL 혼합물을 농축 AuNP 용액 (단계 2.1)에 첨가하고, 5 초 동안 와동시키고, -20 °C에서 적어도 2 시간 동안 동결시킨다. 상기 혼합물을 RT에서 해동한 후, 상기 혼합물을 원심분리(3,500 x g, 5분, RT)하여 과량 첨가된 코팅 DNA를 제거하였다. 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 펠릿을 물 10μL에 재용해시킵니다.참고: 나노포크의 각 AuNP에는 두 개의 코팅 가닥이 있습니다(표 2). 상기 단계들은 DNA 코팅 가닥의 서열을 제외하고는 동일하다. 입자가 코팅되면 매우 안정적입니다. 냉장고에 몇 달 동안 그대로 보관할 수 있으며 냉동할 수도 있습니다. 완전히 코팅된 염료 AuNP의 경우, 코팅 DNA 가닥에는 내부 TAMRA 염료가 있습니다. 3. 도나 어셈블리 코팅된 AuNP 용액을 나노포크 용액에 1.5:1의 농도 몰비로 첨가합니다. 50 mM MgCl2 원액을 사용하여MgCl2를 4 mM의 최종 농도로 첨가한다. 초순수를 사용하여 최종 부피를 20μL로 조정합니다. 열순환기에서 온도 구배를 사용하여 DONA를 혼성화합니다. 먼저 40°C로 급속히 가열한 다음 1°C/10분에 40°C에서 20°C로 냉각한 다음 20°C에서 8°C로 급속 냉각합니다. 4. 겔 전기영동 참고: DONA 용액의 결합되지 않은 나노입자는 아가로스 겔 전기영동에 의해 제거됩니다. 1 % 아가로스 겔을 준비하십시오. 이를 위해, 0.8 g의 아가로스를 5 mMMgCl2로 보충된 80 mL의 1x TAE에 용해시킨다. 2.25 μL의 로딩 완충액(30% 글리세롤, 13 mM MgCl2; 재료 표 참조)을 18 μL의 DONA 용액에 첨가하여 3.2 단계에서 4 mM에서 5 mM MgCl2의 최종 농도에 도달합니다. 로딩 버퍼는 또한 샘플이 젤 포켓 안에 머물도록 합니다. 얼음물 수조에서 60V에서 70분 동안 젤을 실행합니다. 러닝 버퍼는 5 mMMgCl2로 보충된 1x TAE이다. 관심 밴드를 잘라내어 파라핀 플라스틱 필름으로 감싼 현미경 슬라이드에 놓은 다음 두 번째 파라핀 플라스틱 필름으로 감싼 현미경 슬라이드를 사용하여 용액을 짜냅니다. 피펫을 사용하여 압착된 액체를 500μL 튜브에 수집합니다. 5. AFM 및 라만 측정의 Colocalization 실리콘 칩(재료 표 참조)을 10분 동안 플라즈마 처리한 다음, 정제된 DONA 용액 10μL와 100mM MgCl2 10μL를 칩 상에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 에탄올과 물의 1:1 혼합물(부피 기준)로 칩을 두 번 세척하고 압축 공기로 블로우 건조합니다. 그런 다음 칩을 자기 디스크에 테이프로 붙이고 이미징을 위해 기기에 삽입합니다.알림: 측정을 시작하기 전에 라만 여기 레이저의 위치가 AFM 프로브 팁 위에 오도록 조정됩니다. 본 연구에서는 HORIBA Omegascope AFM에 결합된 HORIBA LabRAM HR Evolution 라만 현미경을 사용합니다. 기기는 소프트웨어 LabSpec 및 AIST를 사용하여 제어됩니다. AFM 측정의 경우 ACCESS-NC-A(공진 주파수: 300kHz, 스프링 상수: 45N/m) 팁24와 함께 태핑 모드(AC 모드)를 사용하십시오. AC 모드는 1Hz로 설정된 스캔 속도를 제외한 모든 매개변수를 자동으로 제어합니다.참고: AFM 이미징 후 AFM 팁이 라만 레이저의 경로에 있지 않도록 빼냅니다. 이것은 시스템에 프로그래밍된 매크로 기능인 “Probe away”를 사용하여 수행됩니다. 이러한 방식으로 AFM 이미지에서 선택한 지점에 대해 레이저는 AFM과 비교하여 오프셋 없이 동일한 위치에 있게 됩니다. 라만 측정을 위해 원하는 레이저 파장, 출력 및 축적 시간을 선택하십시오., 이러한 모든 매개변수는 측정된 샘플에 따라 달라지므로 말입니다.완전히 코팅된 TAMRA AuNP 측정을 위해 언급된 파라미터(633nm 레이저, 100μW 전력 및 1초 통합 시간)를 사용합니다. 단일 TAMRA 측정에 언급된 파라미터(633nm 레이저, 400μW 출력 및 4초 통합 시간)를 사용합니다. 매개변수를 조정한 후 AFM 이미지에서 원하는 DONA 위에 커서를 놓습니다. 소프트웨어의 “커서 이동” 기능이 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 라만 측정을 시작합니다.참고: 스펙트럼을 획득하기 위한 다양한 모드가 있습니다: 단일 지점 측정-1차원 시간 매핑-단일 지점이 시간에 걸쳐 측정되는경우 25; 및 2차원 XY 영역 맵핑(2-dimensional XY area mapping)을 포함하는데, 여기서 전동화된 스테이지는 레이저 아래로 이동되어 XY 그리드(26)의 점들의 배열로부터 스펙트럼을 획득한다.