Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

OPMERKING: Een testtijdlijn is weergegeven in figuur 1. 1. Bereiding van RNAi-nematodengroeimedium (RNAi-NGM)-platen Streep E. coli HT115(DE3) met GFP- of controle-RNAi-vectoren uit glycerolvoorraden uit op Luria-Bertani (LB)-agarplaten aangevuld met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer de bacteriën een nacht bij 37 °C. Bereid de volgende dag RNAi-NGM-platen (1,7% [w/v] agar, 0,3% [w/v] NaCl, 0,25% [w/v] pepton, 1 mM CaCl2, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM kaliumfosfaatbuffer [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 μg/ml carbenicilline en 5 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG]) volgens het standaardprotocol18.Bereid voor elke stam in de test minimaal zes RNAi-NGM-platen voor die zijn ingezaaid met GFP-RNAi (twee platen voor elk van de drie biologische replicaten) en twee RNAi-NGM-platen die zijn ingezaaid met controle-RNAi (één biologisch replicaat). Tent de borden losjes met folie om ze tegen licht te beschermen en laat ze een nacht op kamertemperatuur drogen. Bereid op dezelfde dag als het gieten van RNAi-NGM-platen 4 ml vloeibare culturen van RNAi-bacteriën.Onder steriele omstandigheden aliquot 4 ml LB-bouillon aangevuld met 10 μg/ml tetracycline en 100 μg/ml ampicilline in kweekbuisjes. Pluk enkele kolonies van de LB-agarplaten in elke buis en incubeer ze een nacht terwijl ze ongeveer 16 uur bij 37 °C schudden. Zaad RNAi-bacteriën op de RNAi-NGM-platen.Meet na een nacht groei de optische dichtheid (OD600) van culturen met behulp van een 1:5 verdunning van bacteriën met LB-bouillon. Verdun RNAi-bacteriën tot een relatieve OD 600 van 2 met LB-bouillon aangevuld met 10 μg/ml tetracycline en100 μg/ml ampicilline. Voeg onder steriele omstandigheden 150 μL van de controle- of GFP-RNAi-bacteriën toe aan elke RNAi-NGM-plaat. Tent de borden met folie en laat de bacteriën voor gebruik minimaal 24 uur bij kamertemperatuur groeien.OPMERKING: Ongebruikte RNAi-NGM-platen kunnen maximaal 1 week omgekeerd bij 4 °C in een afgesloten container in het donker worden bewaard. 2. Opstart van de RNAi-overervingstest: bleken en plateren van embryo’s voor de P0-generatie OPMERKING: Voordat met de RNAi-overervingstest wordt begonnen, moeten wormen die de GFP-reporter mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 bevatten, gedurende ten minste twee generaties uitgehongerd worden gehouden bij 21 °C. Kies 4 dagen (96 uur) voor de start van de RNAi-overervingstest (Figuur 1) drie of vier drachtige volwassenen op elke standaard NGM-plaat van 35 mm die is ingezaaid met OP50-1-bacteriën.OPMERKING: Drie NGM-platen per stam is voldoende. Voor stammen met een verminderde vruchtbaarheid kunnen meer dan vier dieren per plaat nodig zijn. Zorg er na 4 dagen voor dat de volwassen populatie is begonnen met het leggen van embryo’s op de plaat. Spoel de wormen van de platen in buisjes van 1,5 ml met 800 μL M9-buffer aangevuld met Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Herhaal de wasbeurt en het zwembad in dezelfde buis. Isoleer de embryo’s van de populatie door ze als volgt te bleken.Bereid een bleekoplossing met bleekmiddel (6% natriumhypochloriet) en 10 N NaOH in een volumeverhouding van 1,5:1. Bereid een voldoende hoeveelheid zodat voor elk monster 250 μl kan worden gebruikt. Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met de wormen op 1.000 x g gedurende 1,5-2 min. Zuig het supernatant op, zodat er 100 μL overblijft zonder de worm ‘korrel’ te verstoren. Als alternatief kunnen de buizen ongeveer 2 minuten worden gelaten om de wormen te laten bezinken voordat ze worden opgezogen. Voeg 650 μL ddH2O toe aan elke buis om een eindvolume van 750 μL te verkrijgen.OPMERKING: De volgende stappen zijn tijdgevoelig. Voeg 250 μL bleekoplossing toe aan elk buisje en start een timer. Draai de buizen elke 1-2 minuten grondig. Controleer na 5 minuten de wormen onder de stereoscoop om de afbraak van volwassenen te volgen. Ga door met vortexen totdat de wormen volledig zijn opgelost en er alleen embryo’s overblijven. Centrifugeer de buisjes onmiddellijk op 1.000 x g gedurende 1,5 min.OPMERKING: Het bleken is over het algemeen binnen 6-7 minuten voltooid, maar moet worden gecontroleerd onder een stereoscoop met een vergroting die voldoende is om de vrijgelaten embryo’s te observeren (40x). Laat de wormen niet voor langere tijd in bleekmiddel liggen, omdat dit de embryo’s in gevaar brengt. Zuig na het centrifugeren het supernatans op en laat ongeveer 50-100 μl over. Voeg 1 ml M9-buffer toe met TX-100 om te wassen en meng door middel van vortexen. Centrifugeer opnieuw op 1.000 x g gedurende 1,5-2 minuten en was nog minstens twee keer. Zuig het supernatans uit de laatste wasbeurt op en laat ongeveer 100 μL in de buis. Mengen door vortexen. Pipetteer tweemaal 2 μl uit elke buis op een gelabeld objectglaasje. Tel de embryo’s met behulp van een teller om de concentratie embryo’s per microliter te schatten.OPMERKING: Dia’s met meerdere matte putjes kunnen hier worden gebruikt om replica’s van meerdere stammen te tellen. Telglaasjes kunnen gewassen en hergebruikt worden. Om een semi-gesynchroniseerde populatiegroei op gang te brengen, mengt en pipet u een volume met 250 embryo’s op elke RNAi-NGM-plaat. Gebruik twee platen voor elke replicatie. Laat de vloeistof intrekken. Voor de P0-generatie die met RNAi wordt behandeld, incubeer bij 21 °C gedurende 4 dagen (96 uur) (van embryo’s tot volwassenheid). Tijdstippen kunnen variëren afhankelijk van het genotype. Figuur 1: Schema van de RNAi-overervingstest. Voorgestelde tijdlijn voor RNAi-NGM-plaatvoorbereiding en RNAi-overervingstestopstelling. Drachtige volwassenen worden op dag -4 geplukt op NGM-platen die zijn bezaaid met OP50-1. Na 4 dagen worden volwassen nakomelingen gebleekt en worden embryo’s op RNAi-NGM-platen geplaatst. De P0-generatie wordt gedurende 4 dagen bij 21 °C blootgesteld aan RNAi. Zodra de wormen volwassen zijn, worden replicaten gepasseerd door te bleken en elke generatie gescoord op kiembaan-GFP-expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Passeren en scoren van elke generatie voor kiembaan-GFP-expressie OPMERKING: Om het scoren te vergemakkelijken, gebruikt u een vinylplaat om agarosepads te maken met lineaire ribbels om de wormen op één lijn te brengen. Deze methode is overgenomen van Rivera Gomez en Schvarzstein19. Bereid 1% (m/v) agarose door agarose op te lossen in ddH2O in een kleine kolf door verhitting in een magnetron. Voeg een roerstaaf toe en dek af met folie. Verwarm de agarose bij het omsmelten al roerend op een kookplaat van 200 °C. Eenmaal gesmolten, zet je het vuur lager tot 80 °C. Was de wormen van de NGM-platen met 800 μL M9-buffer met TX-100 in een buis van 1,5 ml. Was de platen twee keer om alle drachtige volwassenen te verwijderen. Controleer de platen onder de stereoscoop om te bevestigen dat de dieren efficiënt zijn opgehaald. Centrifugeer de buisjes op 1.000 x g gedurende 1,5-2 minuten of laat de wormen 2 minuten bezinken. Zuig het supernatans op en laat 100 μL over zonder de wormkorrel te verstoren. Bereid agarosepads als volgt voor op het monteren van de wormen.Plaats een druppel gesmolten 1% (m/v) agarose op de vinylplaat (eerder beschreven19) met behulp van een glazen pasteurpipet (waarvan het smalle uiteinde is afgebroken). Richt een glasplaatje zo dat de lijnen op de plaat horizontaal of verticaal zijn en plaats het glaasje snel op de druppel agarose. Wacht ongeveer 30 seconden voordat u het glasplaatje van de plaat verwijdert.OPMERKING: Als u meerdere genotypen scoort, kan het nuttig zijn om een groter agarosekussen op één glaasje te maken en dit met een mesje doormidden te snijden. Monteer de wormen op de agarosekussentjes.Voeg onder de stereoscoop ongeveer 5 μL 5 mM levamisol toe aan het agarosekussentje. De levamisolverdunning moet elke week vers worden gemaakt. Veeg voorzichtig met de buizen met wormen om te mengen en breng 5-10 μL wormen over op het agarosekussentje. Schat het aantal wormen met het oog terwijl ze worden toegevoegd, zodat er ongeveer 40 wormen per replica zijn. Zet de wormen in rijen op een rij met een wimperprikker om gemakkelijker te scoren. Voeg een glazen dekglaasje toe.NOTITIE: Dia’s met dieren die op deze manier zijn gemonteerd, kunnen enkele uren meegaan voordat ze uitdrogen. Isoleer de embryo’s van de overige dieren met behulp van het bleekprotocol (zie stap 2.3) voordat u de objectglaasjes insnijdt. Plaat 250 embryo’s op 35 mm NGM-platen gezaaid met OP50-120. Zodra de vloeistof is opgenomen, keert u de platen om en plaatst u ze terug in de incubator van 21 °C. Gebruik een bloeiescentie stereoscoop met een GFP filterset. Tel en noteer het aantal GFP-positieve en GFP-negatieve wormen op de objectglaasjes voor elke replicatie met behulp van een teller.OPMERKING: GFP-positieve wormen hebben nucleaire GFP-expressie in hun kiembaan en embryo’s in de baarmoeder. De kiembanen van GFP-negatieve wormen zullen niet fluoresceren, maar als de GFP in latere generaties weer AAN begint te gaan, kan de fluorescentie zwak zijn. Het kan nuttig zijn om extra niet-transgene wormstammen te monteren om rekening te houden met eventuele waargenomen autofluorescentie. Passeer de populatie door te bleken, zoals hierboven beschreven, ongeveer om de 4 dagen (96 uur) bij 21 °C. Als alternatief kan het passeren voor het gemak worden gedaan volgens een afwisselend 3-daags/4-daags schema. Plaat een extra ~ 50 embryo’s voor de kortere passerende generaties als afwisselend, omdat er na 72 uur een lagere opbrengst aan embryo’s kan zijn.OPMERKING: Houd de doorgiftetijd van de P0-generatie consistent 4 dagen na het plateren van embryo’s. 4. Diereninzameling voor ChIP OPMERKING: Het aantal dieren en de timing zijn afhankelijk van de stam, het ontwikkelingsstadium, het epitoop en het aantal immunoprecipitatiedoelen (IP). Verzamel in het onderstaande voorbeeld dieren voor drie IP’s: H3K9me3, histon H3 en IgG-controle. Het ChIP-protocol is overgenomen van Askjaer et al.21. Voorafgaand aan het verzamelen van ChIP-monsters, breidt u de vorige generatie van de RNAi-overervingstest uit met nog eens drie NGM-platen (tot ten minste vier platen per replicaat). 4 dagen kweken bij 21 °C. Bleken de drachtige volwassenen om de embryo’s te isoleren (zie stap 2.3). Plak voor elke stam ongeveer 3.500 embryo’s op 14 platen (250 per plaat) en groei gedurende 3 dagen bij 21 °C tot het jongvolwassen stadium. Was de dieren in buisjes van 1,5 ml met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX) bevatten. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min. Aspireer de dieren van één stam op en voeg ze samen in één buis en was ze nog drie keer met ten minste 1 ml PBS/TX. Aspireer tot 1.000 μL, keer om om te mengen en tel het aantal dieren in 3 μL driemaal (zie stap 2.3.9). Bereken de concentratie van dieren en breng een volume dat overeenkomt met 3.000 dieren over naar een nieuwe buis voor formaldehyde-verknoping. Zorg ervoor dat het totale volume minimaal 10 keer het volume van de wormkorrel is. 5. Formaldehyde verknoping LET OP: Werk met formaldehyde in een zuurkast om blootstelling aan damp te voorkomen. Voeg formaldehyde (1,8% eindconcentratie) toe aan het buisje met de wormen. Draai op kamertemperatuur gedurende 6 min. Onmiddellijk invriezen in vloeibare stikstof. Bij deze stap kan het experiment worden gepauzeerd en kunnen de monsters bij -80 °C worden bewaard. Ontdooi het verknoopte monster gedurende 3 minuten in een waterbad op kamertemperatuur en draai het gedurende 16 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 1,25 M glycine toe tot een eindconcentratie van 125 mM en draai gedurende 5 min.OPMERKING: Bewaar de monsters op ijs of bij 4 °C tot het magnetische parelsignaal en gebruik ijskoude buffers. Centrifugeer het monster bij 1.000 x g gedurende 3 min. Was drie keer met 1 ml PBS/TX per keer. Tweemaal wassen met 1 ml resuspensiebuffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], 0,01% TX-100, proteaseremmer [één tablet per 5 ml]). Laat na de laatste wasbeurt voldoende buffer over om ervoor te zorgen dat het totale volume ten minste drie keer het pelletvolume en een minimum van ~100 μL is. 6. Sonificatie OPMERKING: Sonicatieparameters zijn afhankelijk van het type en model van de sonicator en het stadium van het dier. Parameters zoals monstervolume en -concentratie, aan/uit-intervallen, aantal cycli en vermogensinstelling moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Bewaak bijvoorbeeld gedurende een tijdsverloop van sonicatie de lysis van wormen met behulp van een eiwittest en bepaal wanneer de concentratie een plateau bereikt. Controleer bovendien wanneer de gemiddelde afschuifgrootte van het genomische DNA ongeveer 200-1.000 bp is door elektroforese van DNA, gezuiverd na crosslinking-omkering, op een 1,5% agarose/tris-acetaat-EDTA (TAE)-gel. Meet het volume van de monsters uit de vorige stap. Meng en aliquot 90-120 μL tot een polystyreen sonicatiebuis. Voeg een gelijk volume resuspensiebuffer toe met 2x detergentia (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2% natriumdeoxycholaat, 0,7% sarkosyl). Sonicaat in een waterbadsonicator op 50% vermogen gedurende 7 minuten (20 s aan/40 s uit) bij 4 °C. Meng voorzichtig door te pipetteren. Herhaal de sonicatie nog eens 7 minuten. Breng het gesoniceerde lysaat over in een buis van 1,5 ml. Voeg 0,5 volume resuspensiebuffer zonder reinigingsmiddelen toe (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (voeg bijv. 100 μL buffer toe aan 200 μL monster). Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Houd het lysaat-supernatans en breng over naar een nieuwe buis. Voer eventueel een eiwittest uit om de concentraties van elk lysaat te bepalen. Deze stap kan nuttig zijn voor grote monsterhoeveelheden of vergelijkingen tussen assays. Het standaardiseren van het aantal dieren zoals hierboven beschreven werkt echter goed voor de hier beschreven monsterhoeveelheden, omdat er een betere correlatie is met de opbrengst van chromatine/DNA zoals bepaald door qPCR. 7. Immunoprecipitatie NOTITIE: Schaal de hoeveelheid antilichaam en magnetische korrels naar het volume en de concentratie van lysaat. Verdeel het lysaatsupernatans in vier porties: drie gelijke volumes voor elk IP en 10% van het volume van één IP als input (bijv. 100 μL IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL input). Breng het IP-lysaat over in een PCR-buis van 200 μl en bewaar het ingangslysaat bij -20 °C in een buis van 1,5 ml. Voeg 0,5 μg anti-H3K9me3-antilichaam, antihiston H3-antilichaam of IgG toe aan het juiste IP-monster. Incubeer bij 4 °C gedurende de nacht met rotatie. De volgende dag aliquot 9 μL proteïne G-gecoate magnetische kralen per IP in een enkele buis van 1,5 ml. Was de korrels twee keer met 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% natriumdeoxycholaat). Breng de magnetische kralen in FA-150 buffer opnieuw in resuspend tot het oorspronkelijke volume dat in stap 7.3 hierboven uit de voorraad is gehaald. Voeg 7,5 μL toe aan elk IP-adres. Incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur met rotatie. 8. Wasbeurten en elutie NOTITIE: Om ervoor te zorgen dat de magnetische kralen niet opdrogen, voegt u elke was- of elutiebuffer snel toe na het opzuigen van de vorige wasbeurt. Gebruik elke keer 0,2-1 ml van de volgende bufferoplossingen om de kralen te wassen. Verzamel de kralen op een magnetische standaard om de wasbeurten op te zuigen. Incubeer elke wasbeurt op 4 °C gedurende 5 minuten met rotatie. Volg de volgorde zoals hieronder.Tweemaal wassen met FA-150. Eenmaal wassen met FA-1M (FA-150 met 1 M NaCl). Eenmaal wassen met FA-0.5M (FA-150 met 0.5 M NaCl). Overbrengen naar een nieuwe PCR-buis. Eenmaal wassen met TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% natriumdeoxycholaat). Tweemaal wassen met TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).NOTITIE: Ga door met de monsterverwerking bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Zuig de laatste wasbuffer op. Resuspendeer de magnetische korrels met 50 μL ChIP-elutiebuffer (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en breng over naar een buis van 1,5 ml. Elute bij 65 °C gedurende 15 min in een thermomixer met mengen op 1.000 tpm gedurende 5 s per minuut. Verzamel de kralen op een magnetische standaard en breng het supernatans over in een nieuwe buis. Herhaal de elutie met nog eens 50 μL ChIP-elutiebuffer. Pool de supernatanten voor een totaal van 100 μL. Ga verder met omgekeerde crosslinking en DNA-elutie, zoals hieronder beschreven. 9. Omgekeerde crosslinking en DNA-elutie Ontdooi het invoerlysaatmonster. Vul bij tot 100 μL met ChIP-elutiebuffer. Voeg 16,5 μg RNase A toe aan elk IP- en invoermonster. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur. Voeg 40 μg proteïnase K toe en incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C. Incubeer vervolgens een nacht bij 65 °C. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en zuiver het DNA met een spin-column kit. 10. qPCR-reactie instellen en uitvoeren OPMERKING: De parameters van de primer, de reactie-instelling en de thermocycler moeten worden aangepast om te voldoen aan de aanbevelingen van de fabrikant voor de gebruikte qPCR-reactiemix. Bereid primersets voor die gericht zijn op de GFP RNAi-reporter en de positieve en negatieve verrijkingscontroleregio’s van H3K9me3. De smelttemperatuur van de primer is 60 °C. Zie Tabel met materialen voor primersequenties. Maak voor het invoer-DNA vier viervoudige seriële verdunningen (bijv. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).OPMERKING: Het IP-DNA kan direct of verdund (bijv. 1:2 of 1:3) worden gebruikt om meer reacties mogelijk te maken. De geschiktheid van de verdunning moet empirisch worden bepaald, aangezien de qPCR-prestaties kunnen worden beïnvloed. Organiseer alle reacties die overeenkomen met één primerset op één PCR-plaat. Stel technische duplicaatreacties in voor elke DNA-verdunning van de invoer en elk IP-DNA-monster. Elke reactie van 10 μL bevat 1,5 μL input- of IP-DNA (of elutiebuffer als controle), qPCR-mastermix (1x eindconcentratie), voorwaartse primer en omgekeerde primer (400 nM eindconcentratie voor elke primer). Voer op een real-time thermocycler het volgende programma uit: initiële denaturatie: 95 °C gedurende 4 minuten; amplificatie en fluorescentiedetectie: 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s met een plaataflezing; laatste verlenging: 60 °C gedurende 5 min; smeltcurve: van 60 °C tot 90 °C in stappen van 0,5 °C, 5 s per stap. 11. Bepaling van de versterkingsefficiëntie en verificatie van de productspecificiteit Teken voor elke set input-DNA-verdunningen de vier datapunten met [log10(1/verdunning)] op de x-as en [Input Cq] op de y-as. Bepaal de helling van de lijn met de beste pasvorm. Bereken de versterkingsefficiëntie. Ideale primersets moeten consequent een efficiëntie van 95%-100% weergeven. Controleer of alle reacties één scherpe smeltcurvepiek hebben en of reacties met dezelfde primerset dezelfde smelttemperatuur hebben. Meerdere pieken of verschillende smelttemperaturen kunnen duiden op niet-specifieke versterking. Voer eventueel reacties uit op een standaard 2% agarose/TAE-gel bij kamertemperatuur om de bandmaat van het product te controleren. 12. Berekening van het percentage Input Bereken de ingangsverdunningsfactor. Aangezien 10% van het IP-lysaatvolume als input werd opgeslagen, is de verdunningsfactor voor de 1:5-verdunning van input-DNA 50. Bepaal de IP-verdunningsfactor. Als het IP-DNA niet vóór qPCR wordt verdund, is de verdunningsfactor 1. Bereken het Cq-verschil tussen het IP-adres en de input, gecorrigeerd voor verdunningsfactoren. Bereken het invoerpercentage.