Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток¹. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительный^{потенциал 2} и кальциевый баланс³), клеточной сигнализации ^4,5, апоптозе⁶, синтезе различных биохимических соединений ^7,8 и врожденном иммунном ответе⁹. Митохондриальная дисфункция связана с различными патологическими состояниями и заболеваниями человека¹⁰.

Функционирование митохондрий зависит от генетической информации, расположенной в двух отдельных геномах: ядерном и митохондриальном геномах. Митохондриальный геном кодирует небольшое количество генов по сравнению с ядерным геномом, но все гены, кодируемые мтДНК, необходимы для жизни человека. Митохондриальный белковый механизм, необходимый для поддержания мтДНК, кодируется нДНК. Основные компоненты митохондриальной реплисомы, а также некоторые факторы митохондриального биогенеза уже идентифицированы (рассмотрено в предыдущих исследованиях^11,12). Тем не менее, механизмы репликации и поддержания митохондриальной ДНК все еще далеки от понимания. В отличие от нДНК, митохондриальный геном существует в нескольких копиях, что обеспечивает дополнительный слой для регуляции экспрессии митохондриальных генов. В настоящее время гораздо меньше известно о распределении и сегрегации мтДНК внутри органелл, в какой степени эти процессы регулируются, и если да, то какие белки участвуют¹³. Модель сегрегации имеет решающее значение, когда клетки содержат смешанную популяцию мтДНК дикого типа и мутировавшей. Их неравномерное распределение может привести к образованию клеток с пагубным количеством мутировавшей мтДНК.

До сих пор белковые факторы, необходимые для поддержания мтДНК, были идентифицированы в основном биохимическими методами, биоинформационным анализом или исследованиями, связанными с заболеванием. В данной работе для обеспечения высокой вероятности выявления факторов, ранее избежавших идентификации, описана иная стратегия. Метод основан на мечении мтДНК во время репликации или репарации 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU), нуклеозидным аналогом тимидина. BrdU легко включается в зарождающиеся нити ДНК во время синтеза ДНК и, как правило, используется для мониторинга репликации ядерной ДНК¹⁴. Однако разработанная здесь процедура была оптимизирована для обнаружения BrdU, включенного в мтДНК, с использованием иммунофлуоресценции антител против BrdU.

Этот подход позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку синтеза и распределения мтДНК в клетках человека, культивируемых in vitro. Для проведения испытаний в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время необходима стратегия с высокой пропускной способностью; Поэтому в протоколе предлагается использовать многолуночный формат для культивирования клеток и автоматизированную флуоресцентную микроскопию для визуализации. Протокол включает трансфекцию клеток HeLa человека с библиотекой миРНК и последующий мониторинг репликации или репарации мтДНК с использованием метаболической маркировки вновь синтезированной ДНК с помощью BrdU. Такой подход сочетается с иммуноокрашиванием ДНК с помощью антиДНК-антител. Оба параметра анализируются с помощью количественной флуоресцентной микроскопии. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специального красителя. Чтобы продемонстрировать специфичность протокола, окрашивание BrdU было протестировано на клетках, лишенных мтДНК (клетки rho0), на клетках HeLa при подавлении хорошо известных факторов поддержания мтДНК и на клетках HeLa после лечения ингибитором репликации мтДНК. Уровни мтДНК также измерялись независимым методом, а именно кПЦР.