基于图像的高通量线粒体DNA合成和分布定量

对于大多数真核细胞来说，线粒体是必不可少的细胞器，因为它们在许多细胞过程中起着至关重要的作用。首先，线粒体^是细胞1的主要能量供应商。线粒体还参与调节细胞稳态（例如，细胞内氧化还原²和钙平衡³），细胞信号传导⁴，5^，细胞凋亡⁶，不同生^{化化合物的}合成7^，8和先天免疫反应⁹。线粒体功能障碍与各种病理状态和人类疾病有关¹⁰.

线粒体的功能取决于位于两个独立基因组中的遗传信息：核基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组编码的基因数量很少，但所有mtDNA编码的基因对人类生命都是必不可少的。维持mtDNA所必需的线粒体蛋白机制由nDNA编码。线粒体爬替体的基本成分以及一些线粒体生物发生因子已经被确定（在以前的研究中回顾了^11，12）。然而，线粒体DNA的复制和维持机制仍远未被理解。与nDNA相反，线粒体基因组以多个拷贝存在，这为调节线粒体基因表达提供了额外的层。目前对细胞器内mtDNA的分布和分离知之甚少，这些过程在多大程度上受到调节，如果是，涉及哪些蛋白质¹³。当细胞包含野生型和突变mtDNA的混合群体时，分离模式至关重要。它们的不均匀分布可能导致产生具有有害数量突变mtDNA的细胞。

到目前为止，mtDNA维持所必需的蛋白质因子主要通过生化方法，生物信息学分析或通过疾病相关研究来确定。在这项工作中，为了确保识别以前逃脱识别的因素的高机会，描述了一种不同的策略。该方法基于在复制或修复过程中用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记mtDNA，BrdU是胸苷的核苷类似物。BrdU在DNA合成过程中很容易掺入新生的DNA链中，并且通常用于监测核DNA¹⁴的复制。然而，这里开发的程序已经过优化，可以使用抗BrdU抗体的免疫荧光检测掺入mtDNA中的BrdU。

该方法允许对 体外培养的人类细胞中的mtDNA合成和分布进行高通量定量。需要高通量策略才能在相对较短的时间内在不同的实验条件下进行测试;因此，在协议中建议利用多孔格式进行细胞培养和自动荧光显微镜进行成像。该方案包括用siRNA文库转染人HeLa细胞，以及随后使用BrdU对新合成的DNA进行代谢标记来监测mtDNA的复制或修复。这种方法与抗DNA抗体的帮助下对DNA进行免疫染色相结合。这两个参数都使用定量荧光显微镜进行分析。此外，线粒体用特定的染料可视化。为了证明该方案的特异性，在缺乏mtDNA的细胞（rho0细胞）上测试了BrdU染色，在沉默了众所周知的mtDNA维持因子的HeLa细胞上，以及在用mtDNA复制抑制剂处理后的HeLa细胞上测试了BrdU染色。mtDNA水平也通过一种独立的方法测量，即qPCR。