תהליך עבודה לאופטימיזציה של נוסחת ננו-חלקיקי שומנים (LNP) באמצעות ניסויים מתוכננים בתהליך תערובות ומודלים של אנסמבל מאומת עצמי (SVEM)

ניסוחים של ננו-חלקיקי ליפידים (LNP) עבור מערכות העברת גנים in vivo כוללות בדרך כלל ארבעה ליפידים מרכיבים מהקטגוריות של ליפידים מיוננים, עוזרים ו-PEG ^1,2,3. בין אם ליפידים אלה נחקרים לבד או בו זמנית עם גורמים אחרים שאינם תערובת, ניסויים עבור ניסוחים אלה דורשים עיצובי “תערובת” מכיוון – בהינתן ניסוח מועמד – הגדלת או הקטנת היחס בין כל אחד מהליפידים מובילה בהכרח לירידה או עלייה מקבילה בסכום היחסים של שלושת הליפידים האחרים.

לשם המחשה, ההנחה היא שאנחנו מייעלים ניסוח LNP שכרגע משתמש במתכון מוגדר שיטופל כאמת המידה. המטרה היא למקסם את העוצמה של LNP תוך שאיפה משנית למזער את גודל החלקיקים הממוצע. גורמי המחקר המגוונים בניסוי הם היחסים המולריים של ארבעת השומנים המרכיבים (מיוננים, כולסטרול, DOPE, PEG), יחס N:P, קצב הזרימה וסוג השומנים המיוננים. השומנים המיוננים והמסייעים (כולל כולסטרול) מורשים להשתנות בטווח רחב יותר של יחס מולארי, 10-60%, מאשר PEG, אשר ישתנה בין 1-5% באיור זה. מתכון ניסוח אמת המידה והטווחים של הגורמים האחרים וגרעיניות העיגול שלהם מפורטים בקובץ משלים 1. לדוגמה זו, המדענים מסוגלים לבצע 23 ריצות (קבוצות ייחודיות של חלקיקים) ביום אחד ורוצים להשתמש בו כגודל הדגימה שלהם אם הוא עומד בדרישות המינימום. תוצאות סימולציה של ניסוי זה מופיעות בקובץ משלים 2 ובקובץ משלים 3.

Rampado ו-Peer⁴ פרסמו לאחרונה מאמר סקירה בנושא ניסויים מתוכננים לאופטימיזציה של מערכות אספקת תרופות מבוססות ננו-חלקיקים. Kauffman et ^al.5 שקלו מחקרי אופטימיזציה של LNP באמצעות עיצובי סינון חלקיים וסופיים⁶; עם זאת, סוגים אלה של עיצובים אינם יכולים להתאים לאילוץ תערובת מבלי להזדקק לשימוש ב”משתני רפיון” לא ^{יעילים7} ואינם משמשים בדרך כלל כאשר גורמי תערובת קיימים ^7,8. במקום זאת, “עיצובים אופטימליים” המסוגלים לשלב אילוץ תערובת משמשים באופן מסורתי לניסויים בתהליך תערובות⁹. עיצובים אלה מכוונים לפונקציה שצוינה על-ידי המשתמש של גורמי המחקר והם אופטימליים (באחד ממספר מובנים אפשריים) רק אם פונקציה זו לוכדת את הקשר האמיתי בין גורמי המחקר ותגובותיהם. יש לשים לב כי קיימת הבחנה בטקסט בין “עיצובים אופטימליים” לבין “מועמדים לניסוח אופטימלי”, כאשר האחרון מתייחס לניסוחים הטובים ביותר המזוהים על ידי מודל סטטיסטי. עיצובים אופטימליים מגיעים עם שלושה חסרונות עיקריים לניסויים בתהליך תערובת. ראשית, אם המדען אינו מצליח לצפות אינטראקציה של גורמי המחקר בעת ציון מודל היעד, אז המודל המתקבל יהיה מוטה ויכול לייצר ניסוחים מועמדים נחותים. שנית, עיצובים אופטימליים מציבים את רוב הריצות על הגבול החיצוני של חלל הפקטור. במחקרי LNP, זה יכול להוביל למספר רב של ריצות אבודות אם החלקיקים אינם נוצרים כראוי בכל הקצוות של הגדרות השומנים או התהליך. שלישית, מדענים מעדיפים לעתים קרובות לערוך ריצות ניסוי על פנים מרחב הגורמים כדי לקבל תחושה בלתי תלויה במודל של משטח התגובה ולצפות בתהליך ישירות באזורים שלא נחקרו בעבר במרחב הגורמים.

עיקרון תכנון חלופי הוא לכוון לכיסוי אחיד משוער של מרחב הגורם (מוגבל התערובת) עם עיצוב ממלא חלל¹⁰. עיצובים אלה מקריבים יעילות ניסויית מסוימת ביחס לעיצובים אופטימליים⁹ (בהנחה שכל מרחב הגורמים מוביל לניסוחים תקפים) אך מציגים מספר יתרונות בפשרה שהם שימושיים ביישום זה. תכנון מילוי החלל אינו מניח הנחות אפריוריות לגבי מבנה משטח התגובה; זה נותן לו את הגמישות ללכוד יחסים בלתי צפויים בין גורמי המחקר. זה גם מייעל את יצירת העיצוב מכיוון שהוא אינו דורש קבלת החלטות לגבי אילו מונחי רגרסיה להוסיף או להסיר כאשר גודל הריצה הרצוי מותאם. כאשר נקודות עיצוב מסוימות (מתכונים) מובילות לניסוחים כושלים, עיצובים ממלאים מקום מאפשרים למדל את גבול הכשל מעל גורמי המחקר תוך תמיכה במודלים סטטיסטיים לתגובות המחקר על פני שילובי הגורמים המוצלחים. לבסוף, הכיסוי הפנימי של מרחב הגורמים מאפשר חקירה גרפית בלתי תלויה במודל של משטח התגובה.

כדי לדמיין את תת-המרחב של גורם התערובת של ניסוי תערובת-תהליך, נעשה שימוש ב”חלקות טרינריות” משולשות מיוחדות. איור 1 מניע את השימוש הזה: בקובייה של נקודות שבהן מאפשרים לכל אחד שלושה מרכיבים לנוע בין 0 ל-1, הנקודות שמקיימות אילוץ שסכום המרכיבים שווה ל-1 מסומנות באדום. אילוץ התערובת על שלושת המרכיבים מקטין את שטח הגורם האפשרי למשולש. ביישומי LNP עם ארבעה מרכיבי תערובת, אנו מייצרים שש חלקות טרינריות שונות המייצגות את מרחב הגורמים על ידי התוויית שני ליפידים בכל פעם כנגד ציר “אחרים” המייצג את סכום הליפידים האחרים.

איור 1: אזורי גורם משולש. בחלקת מילוי החלל בתוך הקובייה, הנקודות האפורות הקטנות מייצגות ניסוחים שאינם עולים בקנה אחד עם אילוץ התערובת. הנקודות האדומות הגדולות יותר מונחות על משולש החקוק בתוך הקובייה ומייצגות ניסוחים שעבורם אילוץ התערובת מסופק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בנוסף לגורמי תערובת השומנים, לעתים קרובות ישנם גורם תהליך רציף אחד או יותר כגון יחס N:P, ריכוז חיץ או קצב זרימה. גורמים קטגוריים עשויים להיות נוכחים, כגון סוג שומנים מיוננים, סוג שומנים עוזר או סוג חיץ. המטרה היא למצוא נוסחה (תערובת של שומנים והגדרות לגורמי תהליך) שממקסמת מידה מסוימת של עוצמה ו/או משפרת מאפיינים פיזיוכימיים כגון מזעור גודל החלקיקים וה-PDI (מדד פיזור רב), מקסום אחוזי הקפסולה, וממזערת תופעות לוואי – כגון ירידה במשקל הגוף – במחקרי in vivo . גם כאשר מתחילים ממתכון בנצ’מרק סביר, ייתכן שיהיה עניין באופטימיזציה מחדש בהינתן שינוי במטען הגנטי או כאשר שוקלים שינויים בגורמי התהליך או בסוגי השומנים.

קורנל⁷ מספק טקסט סופי על ההיבטים הסטטיסטיים של ניסויי תערובות ותערובת-תהליך, כאשר מאיירס ואחרים ^{9 מספקים} סיכום מצוין של נושאי תכנון וניתוח התערובת הרלוונטיים ביותר לאופטימיזציה. עם זאת, עבודות אלה יכולות להעמיס על מדענים פרטים סטטיסטיים ועם טרמינולוגיה מיוחדת. תוכנה מודרנית לתכנון וניתוח ניסויים מספקת פתרון חזק שיתמוך מספיק ברוב בעיות האופטימיזציה של LNP מבלי לפנות לתיאוריה הרלוונטית. בעוד שמחקרים מסובכים יותר או בעלי עדיפות גבוהה עדיין יפיקו תועלת משיתוף פעולה עם סטטיסטיקאי ועשויים להשתמש בעיצובים אופטימליים ולא ממלאים מקום, מטרתנו היא לשפר את רמת הנוחות של מדענים ולעודד אופטימיזציה של פורמולציות LNP מבלי לפנות לבדיקות לא יעילות של גורם אחד בכל פעם (OFAT)¹¹ או פשוט להסתפק בנוסחה הראשונה העונה על המפרטים.

במאמר זה, מוצגת זרימת עבודה המשתמשת בתוכנה סטטיסטית כדי לייעל בעיית ניסוח LNP גנרית, ומטפלת בבעיות תכנון וניתוח לפי הסדר שבו הן ייתקלו בהן. למעשה, השיטה תעבוד עבור בעיות אופטימיזציה כלליות ואינה מוגבלת ל- LNPs. לאורך הדרך מטופלות מספר שאלות נפוצות שעולות וניתנות המלצות המעוגנות בניסיון ובתוצאות סימולציה¹². המסגרת שפותחה לאחרונה של מודלים של אנסמבל מאומת עצמית (SVEM)¹³ שיפרה מאוד את הגישה השברירית לניתוח תוצאות מניסויים בתהליך תערובת, ואנו משתמשים בגישה זו כדי לספק אסטרטגיה פשוטה יותר לאופטימיזציה של פורמולציה. בעוד זרימת העבודה בנויה באופן כללי שניתן לעקוב אחריו באמצעות חבילות תוכנה אחרות, JMP 17 Pro ייחודי בכך שהוא מציע SVEM יחד עם כלי הסיכום הגרפיים שמצאנו כנחוצים כדי לפשט את הניתוח הארכאי של ניסויים בתהליך תערובת. כתוצאה מכך, הוראות ספציפיות JMP מסופקות גם בפרוטוקול.

SVEM משתמש באותו בסיס מודל רגרסיה ליניארית כמו הגישה המסורתית, אך הוא מאפשר לנו להימנע משינויים מייגעים הנדרשים כדי להתאים ל”מודל מלא” של השפעות מועמדים באמצעות בחירת קדימה או גישת בסיס בחירה נענשת (לאסו). בנוסף, SVEM מספק התאמת “מודל מופחת” משופרת הממזערת את הפוטנציאל לשילוב רעש (תהליך בתוספת שונות אנליטית) המופיע בנתונים. זה עובד על ידי ממוצע המודלים החזויים הנובעים משקלול חוזר ונשנה של החשיבות היחסית של כל ריצה במודל 13,14,15,16,17,18. SVEM מספק מסגרת למידול ניסויים בתהליך תערובת, שהיא גם קלה יותר ליישום מאשר רגרסיה מסורתית של ירייה בודדת וגם מניבה מועמדים לניסוח אופטימלי באיכות טובה יותר^12,13. הפרטים המתמטיים של SVEM הם מעבר להיקף של מאמר זה ואפילו סיכום שטחי מעבר לסקירת הספרות הרלוונטית יסיח את הדעת מהיתרון העיקרי שלו ביישום זה: הוא מאפשר הליך פשוט, חזק ומדויק של לחץ והפעל עבור מתרגלים.

זרימת העבודה המוצגת עולה בקנה אחד עם גישת איכות לפי עיצוב (QbD)¹⁹ לפיתוח תרופות²⁰. תוצאת המחקר תהיה הבנה של הקשר הפונקציונלי המקשר בין תכונות החומר ופרמטרי התהליך לתכונות איכות קריטיות (CQAs)²¹. דניאל ואחרים ²² דנים בשימוש במסגרת QbD במיוחד לייצור פלטפורמת RNA: זרימת העבודה שלנו יכולה לשמש ככלי במסגרת זו.