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Biologia

식물의 분자 전달을 위한 직접 주입 장치

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65194
, , , , , ,
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

Summary

이 원고는 황룡빙 감귤병과 관련된 박테리아(Candidatus Liberibacter asiaticus) 또는 그 곤충 매개체(Diaphorina citri, Kuwayama)에 대한 분자의 효과를 스크리닝하기 위한 새로운 직접 식물 주입 장치를 설명합니다.

Abstract

식물에서 치료 화합물의 기능을 테스트하는 것은 농업 연구의 중요한 구성 요소입니다. 엽면 및 토양 관주 방법은 일상적이지만 다양한 흡수 및 테스트된 분자의 환경 파괴를 포함한 단점이 있습니다. 나무의 줄기 주입은 잘 정립되어 있지만 대부분의 방법에는 값 비싼 독점 장비가 필요합니다. 황룡빙에 대한 다양한 치료법을 스크리닝하기 위해서는 체관부 제한 박테리아인 Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)에 감염되거나 체관부 먹이 CLas 곤충 벡터 Diaphorina citri Kuwayama(D. citri)에 감염된 작은 온실 재배 감귤 나무의 혈관 조직에 이러한 화합물을 전달하는 간단하고 저렴한 방법이 필요합니다.

이러한 스크리닝 요구 사항을 충족하기 위해 식물의 줄기에 연결되는 직접 식물 주입(DPI) 장치가 설계되었습니다. 이 장치는 나일론 기반 3D 프린팅 시스템과 쉽게 구할 수 있는 보조 구성 요소를 사용하여 만들어집니다. 이 장치의 화합물 흡수 효능은 형광 마커 5,6-카르복시플루오레세인 디아세테이트를 사용하여 감귤 식물에서 테스트되었습니다. 식물 전체에 걸친 마커의 균일한 화합물 분포가 일상적으로 관찰되었다.

또한, 이 장치는 항균 및 살충 분자를 전달하여 CLas 및 D. citri 에 대한 효과를 각각 확인하는 데 사용되었습니다. 아미노글리코시드 항생제 스트렙토마이신은 장치를 사용하여 CLas에 감염된 감귤류 식물에 전달되었으며, 그 결과 처리 후 2주에서 4주로 CLas 역가가 감소했습니다. 네오니코티노이드 살충제 이미다클로프리드를 D. 시트리에 감염된 감귤류 식물에 전달하면 7일 후 차전자피 사망률이 크게 증가했습니다. 이러한 결과는 이 DPI 장치가 테스트를 위해 식물에 분자를 전달하고 연구 및 스크리닝 목적을 용이하게 하는 데 유용한 시스템을 나타낸다는 것을 시사합니다.

Introduction

상업 및 조경 환경에서 식물을 관리하려면 종종 식물의 성장과 건강을 최적화하기 위해 화합물을 사용해야 합니다. 이러한 분자가 전달되는 방법은 분자의 유형, 분자의 기능, 식물의 유형 및 적절한 관리 시스템에 따라 다릅니다. 엽면 및 토양 적용은 가장 쉬운 전달 전략이지만 일부 분자의 흡수 제한으로 인해 직접 전달이 필요합니다. 이러한 분자의 예로는 식물 내에서 전신적으로 이동할 때 가장 잘 기능하지만 간단한 국소 적용으로는 효과적으로 전달할 수 없는 치료 분자가 있습니다1. 이것은 감귤류 녹화 병이라고도하는 황룡빙 (HLB)의 경우입니다. HLB는 식물 외부에서 배양할 수 없는 체관 제한 박테리아인 Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas) 또는 그 곤충 매개체인 Diaphorina citri Kuwayama(D. citri)와 관련된 질병입니다.2.

추정되는 치료 분자가 유전자 산물인 경우 이러한 화합물을 발현하는 형질전환 식물을 만들어 테스트할 수 있습니다. 그러나 형질전환 식물 생산은 시간과 자원이 많이 소요될 수 있고, 유전자형에 따라 크게 달라지며, 유전자 침묵(gene silencing)에 의해 억제될 수 있다3. 또한, 이러한 형질 전환이 유망한 결과를 보일지라도, 규제 및 대중의 인식 제약은 상업적 수용 가능성을 감소시킨다 4,5. 그러나 화합물의 외인성 적용은 분자의 효과를 테스트하는 데 드는 시간과 자원을 줄이는 안정하거나 일시적으로 발현되는 형질전환 식물의 생산을 필요로 하지 않기 때문에 생물학적 및 합성 분자의 테스트를 단순화합니다. 외인성 화합물의 효과적이고 효율적인 전신 식물 전달을 위한 방법은 매우 다양한 연구 및 스크리닝 목적으로 사용될 수 있다.

이러한 응용 분야 중 하나는 식물의 혈관계 내에서 전신 분자 이동을 분석하는 것으로, 형광, 가시광선 또는 고유한 화학 동위원소인지 여부에 관계없이 추적 가능한 마커를 사용하여 수행할 수 있습니다 6,7,8,9. 일반적으로 사용되는 형광 표지자 중 하나는 5,6-카르복시플루오레세인-디아세테이트(5,6-carboxyfluorescein-diacetate)로, 세포내 에스테라제에 의해 5,6-카르복시플루오레세인(CF)으로 분해된 후 형광 및 막 불투과성이 되는 막 투과성 염료입니다10. CFDA는 식물 조직에서 체관 수송, 싱크 및 공급원 관계, 혈관 구조 패터닝을 모니터링하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다11,12.

이러한 마커 외에도 특정 화합물은 식물의 생리를 직접 변경하여 생산성을 높이거나 제초제의 경우 식물을 죽일 수 있습니다. 살충제와 항균 화합물은 특히 HLB의 존재 하에서 식물 생산성을 증가시키는 수단입니다. CLas를 조절하는 데 사용되는 항균 분자의 예는 스트렙토마이신입니다. 스트렙토마이신( Streptomycin)은 원래 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus )에서 분리된 아미노글리코시드 항생제로, 단백질 생합성 억제를 통해 박테리아 성장을 억제하는 것으로 나타났다13. 살충제 측면에서 HLB 연구의 주요 대상은 나무에서 나무로 CLas를 전달하는 D. citri입니다14. 이를 위해 이미다클로프리드(imidacloprid)와 같은 네오니코티노이드(neonicotinoids)가 일반적으로 사용되는데, 이는 해충 방제를 위한 황금 표준이기 때문이다15. 이러한 모든 다양한 용도는 현재 플랜트 관리 전략의 중요한 측면이며, 새로운 제품의 개발은 효율적인 스크리닝 분석에 달려 있습니다.

목본 식물에 화합물을 도입하는 데 사용되는 한 가지 방법은 줄기에 직접 주입하는 것입니다. 사전 천공된 주입 부위에 대한 요구 사항이 다양한 다양한 시스템이 설계되었으며, 이러한 시스템은 압력 기반 주입 또는 수동 흐름(passive flow)을 사용한다(16). 압력 기반 시스템은 주어진 화합물의 빠른 도입을 허용하지만, 막히거나 색전된 맥관 구조를 통해 액체를 강제로 통과시킴으로써 발생할 수 있는 잠재적인 물리적 손상을 고려해야 한다17. 화합물의 엽면 또는 관주 적용은 구현하는데 덜 시간 집약적이지만, 직접 식물 주입은 공기 또는 토양에 대한 손실로 인한 관심 화합물의 낭비를 감소시키고, 또한 외부 환경(18)에 대한 노출을 감소시킴으로써 화합물이 활성 상태에 있는 시간을 연장시킬 수 있다. 이 두 가지 측면은 고가의 시약을 보존하고 연구 환경에서 복제 간의 일관성을 보장하는 데 중요합니다.

이 연구는 관심 화합물이 숙주 식물에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있는 혁신적인 직접 식물 주입(DPI) 장치의 설계, 구성 및 사용에 대해 설명합니다. 표준 3D 프린터는 장치 자체와 그 구성과 관련된 여러 구성 요소를 제조하는 데 사용되었습니다. 이 사내 건설 방법을 통해 연구원은 특정 실험 요구 사항에 따라 장치 및 장치 구성 요소를 수정할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 식물 주입 장치에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다. 장치 설정은 간단하고 효율적이며 모든 보조 구성 요소를 쉽게 사용할 수 있고 저렴합니다. 이 시스템은 다양한 식물 종과 함께 사용하도록 설계되었지만 여기에 제시된 예는 화분에 심은 감귤류 식물과 관련이 있습니다. 또한, 이 연구는 이 장치가 치사율을 일으키지 않고 어린 감귤류 식물에 여러 유형의 화합물을 전신적으로 효율적으로 전달할 수 있음을 보여줍니다. 테스트 된 화합물에는 식물의 화합물 분포를 평가하는 데 사용 된 CFDA와 스트렙토 마이신 및 이미 다클로 프리드가 포함되었으며, 이는 DPI를 통해 전달 될 때 이러한 화합물의 항균 및 살충 효과가 관찰되는지 확인하는 데 사용되었습니다.

Protocol

1. 실험용 화합물 주입용 감귤류 식물 생산 뿌리를 내린 식물 절단이나 씨앗에서 작은 화분에 심은 감귤 나무를 전파하십시오. 화분에 심은 감귤 라인을 16 시간 / 8 시간의 밝은 / 어두운 낮 길이와 28 ° C에서 재배하십시오. 실험에 적합한 크기의 감귤 식물을 선택하십시오. 설명된 응용 프로그램은 식물의 높이가 12cm에서 100cm 사이이고 줄기 직경이 4-14mm여야 합니다. 새로운 플러시 성장이 필요한 경우 실험 전에 식물을 잘라냅니다. 2. DPI 장치 및 금형 구성 요소의 3차원 인쇄 폴리 비닐 아세테이트 기반 접착제를 프린트 베드에 얇게 바릅니다. 나일론 필라멘트를 3D 프린터에 넣고 제조업체의 지침에 따라 프린터를 준비합니다. 원하는 . STL 파일(보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4, 보충 파일 5, 보충 파일 6, 보충 파일 7, 보충 파일 8, 보충 파일 9, 보충 파일 10, 보충 파일 11, 보충 파일 12, 보충 파일 13 및 보충 파일 14)을 설정하고 인쇄를 시작합니다. 프린트 베드에서 조각을 제거합니다. 인쇄된 구성 요소의 바닥에서 폴리비닐 아세테이트 기반 접착제를 물로 헹구고 지지 구조를 제거합니다. DPI 구성 요소에 투명 광택 스프레이 페인트를 두 번 코팅합니다. 3. 플라스티졸 링 몰드의 제작 베이스에 스냅 결합 플라스틱 블록을 사용하여 직사각형 인클로저를 구축하여 패턴 조각을 고정할 수 있을 만큼 충분히 큰 금형 형태를 조립합니다(보충 그림 S1A). RTV 실리콘 모노머와 촉매를 10:1 비율로 혼합하고 1분 동안 기포 없이 저어줍니다. 식용 색소(실리콘 혼합물 3방울/25mL)와 손 비누(비누 1mL/실리콘 혼합물 25mL)를 첨가하여 색칠합니다(보충 그림 S1B). 바닥을 완전히 덮기에 충분한 실리콘 얇은 층을 금형 형태로 붓습니다. Tamp 표면을 평평하게 하고 실리콘이 굳을 때까지 24시간 동안 기다립니다(보충 그림 S1C). 위에서 설명한 대로 패턴의 중앙 구멍 코어 프린트를 덮을 만큼 충분히 깊은 실리콘의 두 번째 층을 붓습니다( 보충 그림 S1D의 패턴 상단에서 볼 수 있음). 중앙 구멍 코어 프린트가 아래를 향하도록 하여 패턴을 액체 실리콘에 삽입합니다. 기포가 갇히지 않고 패턴이 잘 분리되어 있고 닿지 않는지 확인하십시오(보충 그림 S1E). 패턴이 굳는 동안 실리콘에서 튀어 나오지 않도록 무거운 물체 및/또는 테이프로 패턴을 고정합니다. 새로 부은 레이어가 굳을 때까지 24시간 동안 기다립니다(보충 그림 S1F). 레벨이 패턴 상단과 같은 높이가 될 때까지 실리콘을 추가로 붓습니다. 경화될 때까지 24시간 동안 기다리십시오(보충 그림 S1G). 스냅 결합 플라스틱 블록을 분해하여 금형을 분리합니다. 패턴을 제거합니다(보충 그림 S1H). 금형에 찢어짐이나 기형이 있는지 검사합니다(보충 그림 S1I). 4. 플라스티졸 링의 주조 금형 내부, 모든 핵심 구성 요소 및 O-링을 식용유로 코팅합니다(보충 그림 S2A, B). 중앙 포스트 코어 중앙의 노치 주위에 O-링을 놓고 코어를 플라스티졸 링 몰드의 중앙 구멍에 놓습니다(보충 그림 S2C). 전달 채널 코어를 플라스티졸 링 몰드 측면의 구멍에 삽입합니다. 전달 채널 코어의 끝에 있는 V자형 팁을 중앙 포스트 코어의 O-링과 정렬하도록 합니다(보충 그림 S2D,E). 짧은 10초 동안 전자레인지에 플라스티솔을 가열합니다(보충 그림 S2F, G). 거품이 생기지 않도록 플라스티졸을 부드럽게 저어줍니다(보충 그림 S2H). 용액이 160°C와 170°C 사이의 온도에 도달할 때까지 가열 및 교반을 반복한다(보충 그림 S2I).주의 : 플라스티졸이 과열되면 유독 가스가 방출될 수 있습니다. 환기가 잘되는 곳이나 흄 후드에서 절차를 수행하십시오. 플라스티졸을 170°C 이상으로 가열하지 마십시오. 용융된 플라스티졸을 기포를 도입하지 않고 몰드의 바깥쪽 가장자리 근처에 있는 플라스티졸 링 몰드에 붓습니다(보충 그림 S2J). 플라스티졸 링이 식을 때까지 1시간 동안 기다립니다(보충 그림 S2K). 금형에서 링을 제거합니다. 실험적 분석에 사용하기 전에 DPI 장치에 적절하게 맞는지 확인하십시오(보충 그림 S2L). 5. DPI 장치를 플랜트에 부착 트렁크에서 장치 부착을 위해 매끄럽고 건강한 사이트를 찾으십시오. 범프나 매듭은 장치 누출의 원인이 될 수 있으므로 피하십시오. 직경 2mm의 드릴 비트를 사용하여 몸통 표면과 90° 각도로 스템 중앙을 통해 수평으로 구멍을 뚫습니다(보충 그림 S3A). 구멍에 드릴 비트를 여러 번 실행하여 청소하고 매끄럽게 하여 막히지 않은 구멍을 만듭니다(보충 그림 S3B). 화합물 전달 채널의 반대쪽에 있는 플라스티졸 링에 수직 슬라이스를 만듭니다(보충 그림 S3C). 플랜트 주위에 링을 끼우고 이전에 뚫은 구멍에 전달 채널을 정렬합니다(보충 그림 S3D).알림: 링은 누출을 방지하기 위해 트렁크 주위에 꼭 맞아야 합니다. 다양한 직경의 코어 어셈블리를 사용하여 다양한 크기의 식물 줄기를 위한 플라스티졸 링을 만들 수 있습니다. DPI 장치를 플라스티졸 링에 추가하여 서로 꼭 맞는지 확인합니다. DPI 장치 스파우트를 플라스티졸 링 전달 채널 및 뚫린 구멍에 맞춥니다(보충 그림 S3E).알림: 드릴 비트를 사용하여 구멍과 DPI 장치 스파우트를 정렬하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 장치를 제자리에 고정하기 위해 실리콘 테이프로 단단히 감쌉니다(보충 그림 S3F). 완전히 조립 및 부착된 장치를 검사하여 플랜트에서 적절한 정렬과 방향을 확인하십시오. 6. DPI 장치를 사용하여 관심 화합물 적용 주사기 또는 피펫을 사용하여 DPI 장치에 관심 용액을 채웁니다(보충 그림 S3G). 주사기를 사용하여 DPI 장치의 반대쪽에 있는 실리콘 테이프와 플라스티졸 링을 관통하여 내부 채널에서 공기를 빼내고 식물 혈관 구조에 기포가 유입되는 것을 방지합니다(보충 그림 S3H). 추출된 화합물을 DPI 장치로 다시 교체합니다. 주사기로 만든 구멍 위에 작은 실리콘 테이프 패치를 추가하여 해당 부위를 강화하고 찢어지는 것을 방지합니다. 장치의 부착 지점에서 눈에 보이는 누출이 있는지 검사하고 장치 저장소의 액체 레벨이 안정적인지 검사합니다.알림: 테스트 용액의 낭비를 방지하기 위해 처음에 누출을 테스트하는 데 물을 사용할 수 있습니다. DPI 장치의 열린 끝을 왁스 밀봉 필름으로 덮고 아래로 당겨 밀봉을 형성하고 실험 화합물의 증발을 줄입니다. 진공이 발생하는 것을 방지하기 위해 주사기 팁으로 왁스 필름에 단일 구멍을 뚫은 다음 장치를 다시 채웁니다(보충 그림 S3I). 구성 요소가 적절하게 정렬되었는지 확인하기 위해 매일 장치를 점검하고(보충 그림 S3J) 저장소가 마르지 않도록 주사기를 사용하여 액체를 보충합니다. 원하는 양의 실험 용액이 도입될 때까지 이 과정을 반복합니다.알림: 화합물은 최대 1개월 동안 주어진 장치에서 성공적으로 도입될 수 있습니다. 이 시간 프레임을 초과하는 용액 섭취 기간은 실험 설정 전에 경험적으로 테스트해야 합니다. 7. CFDA를 사용하여 감귤류 식물의 혈관 운동 관찰 DPI 장치를 25cm 높이의 유자(Citrus medica L.) 식물에 부착하고H2O대조군 또는 CFDA의 20% DMSO의 단일 2.0mL 처리를 DPI 장치에 적용하고 24시간 동안 흡수되도록 합니다. 이 프로토콜을 따르기 위해, 400 μL의 CFDA 원액(원액은 100% 디메틸 설폭사이드[DMSO]에 용해된 10 mM CFDA를 함유함)에 1.6 mL의H2O를 첨가하여 2 mM 및 20% DMSO의 최종 CFDA 농도를 생성함으로써 작업 CFDA 용액을 제조한다. 식물의 다양한 조직의 단면을 만들고 498nm 파장을 포함하는 형광 필터가 있는 입체경 또는 복합 현미경을 사용하여 식물 조직의 CFDA를 시각화합니다. 이미지를H2O대조군의 20% DMSO와 비교하여 조직에서의 자가형광을 설명한다. 8. 스트렙토마이신 처리 후 잎 샘플에서 CLas 역가의 변화 측정 0.75m 높이의 온실 재배 CLas에 감염된 발렌시아(Citrus sinensis (L.) Osbeck “Valencia”) 식물을 사용하여 각 식물에서 두 개의 HLB 증상이 있는 잎의 잎자루와 중엽을 수집하고, 작은 부분으로 자르고, 각 조직 유형을 풀링하고, 직경 6.35mm의 강철 볼이 들어 있는 2mL 내충격성 샘플 튜브에 별도로 보관합니다. 3.4m/s에서 두 번의 15초 주기로 프로그래밍된 균질기를 사용하여 샘플을 분쇄합니다. 앞서 기술한 바와 같이 총 핵산을 추출한다19. 표 1에 정의된 qPCR 혼합물 및 표 2에 정의된 반응 조건을 사용하여 CLas에 감염된 잎 샘플에 대해 qPCR을 수행합니다. 추가 분석을 위해 강력한 CLas 감염(강력한 감염은 일반적으로 CLas 16S LasLong(LL) 프라이머 세트의 경우 qPCR 기반 Ct 값이 30< 정의됨)을 나타내는 식물을 사용하십시오.참고: 박테리아 역가는 CLas 16S Las Long(LL) 및 감귤류 데히드린 DNA 프라이머를 사용하여 추정하여 앞서 설명한 바와 같이 상대적 게놈 등가물을 추정합니다20. 위에서 설명한 최소 감염 역가를 충족하는 감귤류 식물에 DPI 장치를 장착하고 원하는 농도의 H2O용액 또는 스트렙토마이신 용액 2.0mL를 1회 처리합니다. 이 연구를 따르려면 H2O에 용해된 9.5mg/mL(총 19mg) 스트렙토마이신의 단일 2.0mL 처리를 사용하십시오. 치료 후 7일, 14일 및 28일에 잎 샘플을 수집합니다. CLas 역가에 대해 샘플링된 잎을 상기와 동일한 프로토콜을 사용하여 분석한다. 처리 60일째에H2O또는 스트렙토마이신으로 처리된 식물의 사진을 얻습니다. CLas 감염의 시각적 관찰을 사용하여 감염 중증도를 평가합니다. 경미한 감염의 징후로 잎 플러시 성장과 함께 정맥 간 백혈병 및 정맥 코르킹을 보이는 잎의 <50 %와 더 심각한 감염의 징후로 잎 이탈 및 식물 성장 저해뿐만 아니라 정맥 간 백화 현상 및 정맥 코르킹이있는 잎의 50 % 이상을 찾으십시오. 9. 이미다클로프리드 치료 후 D. citri 의 사망률 측정 0.5m 높이의 유자(Citrus medica L.) 식물을 12cm 높이로 잘라내어 새로운 홍조의 성장을 촉진합니다.알림: 플러시 성장 속도는 식물의 건강과 연중 시기에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 실험 설계 중에 이것을 고려하십시오. 길이 1-2cm의 >6 플러시가 발달 한 후 성인 D. citri 가 들어있는 새장에 식물을 도입하십시오.알이 쌓일 수 있도록 식물을 새장에 24시간 동안 두십시오. 산란 후 1-2 일 후에 3 번의 플러시 싹에 대한 대표적인 달걀 수를 실시한 다음 DPI 장치를 적용하십시오. 이 장치를 2.0mL의 물 조절 또는 원하는 농도의 이미다클로프리드(21.8% 활성 성분)로 채웁니다. 이 프로토콜을 따르려면 528μL/L, 52.8μL/L 및 5.28μL/L의 이미다클로프리드를 사용하십시오.참고: 알 수는 파괴적인 측정이므로 이 단계의 수는 동일한 식물의 계산되지 않은 플러시에서 알 수를 추정하고 실험이 끝날 때 수행되는 후속 님프 출현 수에 대한 기준선을 제공하는 데 사용됩니다. 나머지 플러시 싹 중 최소 3개에서 D. citri 출현률을 수집합니다. 화합물 도입 후 7일 후에 대표적인 식물 사진을 획득합니다.

Representative Results

직접 주입 장치 구성 요소직접 주입 장치의 기본 버전은 전면 및 측면 높이 8cm, 너비 3.3cm입니다(그림 1A). 스파우트와 인접한 단일 중앙 저장소가 포함되어 있으며 이러한 구성 요소 내에 포함될 수 있는 총 부피는 2.0mL입니다(그림 1D). 플라스티졸 링은 높이가 1.8cm이고 직경이 2.7cm입니다(그림 1C). 이 링에는 DPI 장치 스파우트를 수용하기 위한 채널과 처리 중인 나무의 줄기 주위에 맞는 가변 직경의 채널이라는 두 개의 채널도 포함되어 있습니다. 또한 수직 채널 주위에 홈이 있어 나무를 둘러싸도록 과도한 처리를 지시하여 껍질을 통한 추가 화합물 흡수를 허용합니다(그림 1F). 제대로 조립되면 플라스티졸 링이 DPI 장치와 같은 높이가 되어야 하고 스파우트가 나무에 뚫린 구멍과 일직선이 되어야 합니다(그림 1B 및 그림 1E). 증권 시세 표시기감귤류 식물에 외인성 화학 물질을 도입하기 위한 DPI 장치의 효과를 조사하기 위해 장치를 사용하여 2.0mL의 2mM CFDA를 침윤시켰습니다. 형광 신호는 처리된 식물의 맥관 구조에서 검출되었지만(도 2A)H2O에서 20% DMSO로 처리된 대조 식물에서는 존재하지 않았다(도 2B). 이 신호는 잎 중간체, 잎자루 혈관 구조, 줄기 혈관 구조 및 뿌리 혈관 구조를 포함한 모든 해부된 식물 조직 유형에서 관찰되었습니다(그림 2C). 이 신호는 처리 후 24시간 이내에 식물에서 관찰되었으며 조직 전체에 비교적 고르게 분포되었습니다. 스트렙토마이신도입된 화합물이 HLB 질환에 치료 효과가 있는지 여부를 테스트하기 위해 살균 화합물인 스트렙토마이신 2.0mL를 CLas 양성 발렌시아(Citrus sinensis) 스위트 오렌지 식물에 9.5mg/mL(총 19mg)의 농도로 도입했습니다. 이 식물들은 온실 화분에 보관되었고, CLas 역가(감귤류 게놈 당량당 CLas 게놈 등가물로 측정됨)는 qPCR을 사용하여 시간 경과에 따라 모니터링되었습니다(그림 3A). 스트렙토마이신 및H2O-처리된 식물에 대한 초기 평균 DNA CLas 역가는 각각 0.562 CLas 게놈/감귤 게놈 및 0.49 CLas 게놈/감귤 게놈이었다. 평균 박테리아 역가의 감소는 동일한 시점에서H2O대조군과 비교했을 때 스트렙토마이신 처리 후 7-28일에 qPCR에 의해 검출되었습니다. 또한, 시간 0과 28일째 평균 박테리아 역가의 차이는 스트렙토마이신 처리 식물 및H2O처리 식물에 대해 각각 0.314 및 0.117이었다. 이 실험은 서로 다른 기간 동안 서로 다른 처리에 대한 식물의 반응을 측정하기 위해 고안되었습니다. 시간은 4개 수준(0일, 7일, 14일, 28일)의 정량적 이산 요인으로 처리되고 2개 수준(H 2 O 및 스트렙토마이신)의 범주형 요인으로 처리되는 2요인2차 반응 표면 설계가 사용되었습니다. 8개의 처리 조합 각각에 대해 5개의 반복실험이 사용되었고, CLas 역가가 반응 변수로 측정되었다. 데이터는 Box-Cox 플롯 분석에 기초하여 로그10을 사용하여 변환되었습니다. 모델 축소는 Akaike의 정보 기준(AICc)21을 사용하여 전방 선택에 의해 수행되었으며, 그 결과 시간 및 상호 작용 효과가 모두 제거되었습니다. 나머지 인자인 처리는 유의했으며(p = 0.0252), 스트렙토마이신 처리된 식물은 결합된 모든 시점에서H2O-처리된 식물(0.496)보다 더 낮은 평균 CLas 역가(0.349)를 나타냈다(도 3B). 이러한 CLas 역가의 감소는 스트렙토마이신 처리된 식물에서 60일 후 새로운 건강한 플러시 성장의 간헐적인 증가와 일치했으며, 이는H2O(그림 3C) 대 19mg의 스트렙토마이신(그림 3D)으로 처리된 대표적인 나무의 사진에 의해 입증됩니다. 이미다클로프리드이미다클로프리드는 D. citri 살충 스크리닝 분석법으로서의 잠재력을 테스트하기 위해 DPI 장치를 사용하여 어린 아시아 감귤류 차전자피(ACP)에 감염된 유자 식물에 도입되었습니다. 상업용 이미다클로프리드 살충제 용액의 단일 2.0mL 처리는 물 대조군과 함께 세 가지 다른 농도(5.28μL/L, 52.8μL/L 및 528μL/L)에서 테스트되었습니다. 처리 전 3번의 플러시 새싹당 평균 총 알 수는 280.5에서 321 사이였으며 각 처리 그룹에 사용되는 식물 간에 유의미한 차이는 없었습니다(그림 4A). 처리 7일 후 3개의 플러시 새싹에서 생존한 평균 총 애벌레는 수분 대조군의 경우 각각 293.75, 268, 97.5 및 2, 5.28μL/L, 52.8μL/L 및 528μL/L 이미다클로프리드 용액이었습니다(그림 4B). 이는 52.8 μL/L(p = 0.029) 및 528 μL/L(p =0.002) 이미다클로프리드 용액 수준에서 Tukey의 사후 분석에 따른 물 대조군과 비교할 때 차전자피 요충 출현의 상당한 감소를 나타냅니다. 또한, 가장 높은 이미다클로프리드 용액 수준에서 차전자피 요충 사망률의 이러한 증가는 물 대조군(그림 4C)과 비교할 때 이미다클로프리드 처리 라인(그림 4D)에서 요충 단물 생산의 감소에 의해 시각적으로 분명했습니다. 그림 1: 직접 식물 주입 장치 및 플라스티졸 링. (A) 온전한 직접 식물 주입 장치 및 (C) 플라스티졸 링과 그 치수. (B) 감귤나무에 직접 식물 주입 장치 및 플라스티졸 링이 연결되고 부착되는 단계. (D) 식물 직접 주입 장치, (F) 플라스티졸 고리, 및 (E) 감귤 나무에 연결 및 부착된 이들 두 성분의 수직 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : 25cm 감귤류 식물의 잎 중엽의 단면. 식물 직접 주입 장치를 사용하여H2O중 (A) 2 mM CFDA 또는 (B) 20% DMSO로 처리한 후 24시간을 나타내는 이미지. (C) 2mM CFDA 처리 후 24시간 후 다양한 식물 조직의 단면, 직접 식물 주입 장치 위 5cm의 줄기(왼쪽 상단), 직접 식물 주입 장치 아래 5cm의 줄기(왼쪽 중앙), 뿌리(왼쪽 아래), 잎 중엽(오른쪽 상단), 잎자루(오른쪽 중간) 및 잎 중간엽(오른쪽 아래). 스케일 바 = 1mm. 약어: CFDA = 5,6-카르복시플루오레세인-디아세테이트; DMSO = 디메틸 설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: qPCR을 사용하여 시간 경과에 따른 CLas 역가(감귤류 게놈 등가물당 CLas 게놈 등가물로 측정)를 모니터링합니다. (A) 19mg의 스트렙토마이신으로 처리된 5개의 식물과H2O대조군으로 처리된 5개의 식물을 비교하여 CLas DNA 역가의 변화를 보여주는 시간 경과. 점수는 주어진 시점에서 주어진 치료에 대한 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. (B) 모든 시점에 걸쳐H2O- 및 스트렙토마이신-처리된 식물의 평균 CLas 역가를 나타내는 막대 그래프. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타내고, 별표는 일원 분산 분석에 따른 스트렙토마이신 및 H2O처리 식물에 대한 평균 CLas 역가 사이의 유의한 차이(* = p < 0.05)를 나타낸다. (C) (C) H2O또는 (D) 스트렙토마이신으로 직접 식물 주입 처리 후 0개월 및 2개월 후 감귤 식물의 대표 이미지. 스트렙토마이신으로 처리된 식물은 2개월 후에 새로운 연한 녹색 잎 플러시 성장을 보이며, 이는 CLas 역가의 감소를 시사합니다. 약어: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 어린 ACP에 감염된 유자 식물에서 차전자피 애벌레 사망률 모니터링. (A) 추정된 초기 난자 수 및 (B) 물 대조군 및 이미다클로프리드의 다양한 희석액으로 처리한 후 7일 후 3개의 감귤류 플러시에서 생존한 D. citri 님프를 보여주는 막대 그래프. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고, 별표는 Tukey의 사후 분석에 따른 일원 분산 분석에 따른 주어진 처리 수준과 물 제어 사이의 유의미한 차이(* = p < 0.05, ** = p < 0.01)를 나타냅니다. D. citri 님프에 감염된 감귤류의 이미지는 (C) 물 조절 또는 (D) 직접 식물 주입 장치를 사용하여 528μL/L 이미다클로프리드로 처리한 후 7일 후에 플러시됩니다. 약어: ACP = 아시아 감귤류 psyllid; D. citri = 디아포리나 시트리 쿠와야마. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 시료당 부피(μL) 구성 요소 12.5 2x GoTaq qPCR(BRYT Green Dye Master Mix 포함) 5 DNA 템플릿(20ng/μL) 0.5 CLas용 10μM 프라이머 F 및 R Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG(앞으로);TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (역방향) 0.5 감귤류 하우스키핑을 위한 10μM 프라이머 F 및 R 시트러스 데히드린: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (전방);AAAACTTCACCGATCCACCAG (역방향) 6.5 H2O 표 1: 스트렙토마이신 처리된 감귤류 라인에서 CLas 역가를 정량화하는 데 사용된 qPCR 혼합물. CLas DNA 정량 및 감귤 DNA 정량을 위한 16S Las Long 프라이머 및 감귤 데히드린 프라이머의 서열을 나타내었다. 걸음 온도(°C) 시간 1 초기 변성 95 2 분 2 변성 95 15초 3 어 닐 링 60 20초 4 확장 72 20초 5 2단계로 이동하여 39회 반복 6 용융 곡선 0.2°C/s에서 95까지 60 램핑 3 분 표 2: 스트렙토마이신 처리된 감귤 라인에서 CLas 역가를 정량화하는 데 사용된 qPCR에 대한 반응 조건. 보충도 S1: 플라스티졸 링을 생성하는 몰드의 조립 과정을 보여주는 이미지. (A) 함께 스냅 결합 플라스틱 블록을 사용하여 플라스티졸 링 몰드의 첫 번째 층을 생성했습니다. (B) 실리콘 RTV 고무, 촉매, 식용 색소 및 비누를 포함하는 균일하게 혼합된 용액. (C) 플라스티졸 링 몰드의 제1 층을 고르게 붓는다. (D) 상단에 중앙 홀드 코어 프린트가 있는 플라스티졸 링 패턴의 사진. (E) 경화되지 않은 몰드의 제 2 층에 삽입된 플라스티솔 고리 패턴. (F) 마스킹 테이프와 고무 망치는 두 번째 층이 경화될 때 패턴을 고정하는 데 사용됩니다. (G) 패턴의 상단과 같은 높이가 될 때까지 몰드의 세 번째 층을 추가합니다. (H) 금형에서 패턴을 제거합니다. (I) 완전히 구성된 플라스티졸 링 몰드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 S2: 직접 식물 주입 장치와 관련된 플라스티졸 링의 조립 과정을 나타내는 이미지. (A) 몰드, O-링이 있는 중심 코어 및 전달 채널 코어를 포함한 플라스티솔 링 어셈블리 구성 요소. (B) 경화 후 플라스티졸 링의 제거를 용이하게 하기 위해 논스틱 스프레이 식용유로 코어를 코팅합니다. (C) 중앙 코어와 O-링을 금형에 삽입합니다. (D) 중심 코어에 수직인 전달 채널 코어의 삽입. (E) 몰드 캐비티에서 플라스티졸 링 코어 구성 요소의 적절한 조립. (F) 플라스티졸 고리의 생성에 사용되는 플라스티솔. (G) 플라스티졸을 전자레인지로 가열한다. (h) 가열 후 플라스티졸을 교반한다. (i) 플라스티졸 온도를 확인하는 단계. (J) 가열된 플라스티졸을 조립된 코어에 붓는 단계. (K) 조립된 코어 주위의 플라스티졸의 냉각을 허용합니다. (L) 직접 식물 주입 장치에 부착된 완전히 조립된 플라스티졸 링. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 S3: 직접 식물 주입 장치의 조립 과정을 보여주는 이미지. (A) 감귤 식물의 중심을 통해 구멍을 뚫어 화합물 전달을 위한 채널을 만듭니다. (B) 천공된 구멍의 정면도. (C) 화합물 전달 채널 반대쪽에 면도날로 플라스티졸 링을 슬라이스합니다. (D) 이전에 뚫린 구멍 부위의 줄기 주위에 플라스티졸 링을 단단히 끼웁니다. (E) 직접 식물 주입 장치를 플라스티졸 링에 장착하고, 장치의 화합물 전달 꼭지를 플라스티졸 링의 채널에 삽입합니다. (F) 실리콘 테이프를 사용하여 직접 식물 주입 장치를 플라스티졸 링에 고정하고 전체 장치를 제자리에 고정합니다. (g) 직접 식물 주입 장치 챔버를 관심 화합물로 채우는 단계. (H) 주사기를 사용하여 플랜트의 뚫린 구멍에서 공기를 빼내고 화합물의 흐름을 시작합니다. (i) 직접 식물 주입 장치 챔버의 개구부에 왁스 밀봉 필름을 도포하고 진공을 방지하기 위해 구멍을 뚫는 단계. (J) 감귤류 식물에 완전히 조립된 직접 식물 주입 장치. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 4mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 2: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 6mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 3: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 8mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 4: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 10mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 5: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 12mm 트리의 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 6: 플라스티졸 링 센터 포스트 코어. 14mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 7: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 4mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 8: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 6mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 9: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 8mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 10: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 10mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 11: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 12mm 트리의 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 12: 플라스티졸 링 전달 채널 코어. 14mm 트리에 대한 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 13 : 직접 식물 주입 장치 . STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 14: 플라스티졸 링의 몰드를 만드는 데 사용되는 패턴입니다. STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

DPI 장치가 식물에 외인성 화합물을 전달하기 위한 실행 가능한 방법으로 간주되려면 다양한 조직 유형으로의 강력하고 일관된 화합물 흡수에 기여해야 합니다. CFDA를 활용한 실험은 잎의 혈관계 및 중엽 세포뿐만 아니라 아크로페탈 및 기저엽 화합물 이동을 명확하게 보여주었습니다. 추가적으로, 그리고 아마도 이 DPI 장치에 사용된 천공이 복합 흡수를 위한 많은 양의 표면적을 제공하기 때문에, CFDA는 줄기 주입을 사용하는 식물에 대한 이전의 염료 흡수 연구에서 볼 수 있듯이 장치에 인접한 맥관 구조의 작은 하위 집합뿐만 아니라 줄기의 모든 부분에 비교적 동일한 양으로 존재하였다6. 추가적으로, 녹색 형광 단백질 및 꽃 염료의 전달은 DPI 장치를 사용하여 테스트되었으며, CFDA와 유사한 이들 화합물의 분포가 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 데이터는 장치가 크기 및 분자 구조가 다양한 다양한 화합물을 전신적으로 전달하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 그러나 잎 발달 단계에 따라 복합 흡수에 차이가 있었으며, 어린 발달 잎이 오래된 기존 잎보다 더 많은 화합물을 차지한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이는 싱크대 소스 조직에 존재하는 혈관 구조 특성의 변화 때문일 수 있으며 주어진 실험에 최적화되어야 합니다.

DPI 장치는 CFDA, GFP 및 꽃 염료의 시각화를 위한 충분한 화합물 흡수를 보여주었고 각각 스트렙토마이신과 이미다클로프리드의 항균 및 살충 효과를 보여주기에 충분했습니다. 이들 화합물 모두 단일 2.0 mL 처리 후 1주일 후에 표적 유기체 생존율의 변화를 초래하였다. 이러한 데이터는 DPI 장치가 미생물 및 해충 방제를 위한 다양한 화합물의 생존력을 테스트하기 위해 전체 식물 분석에 사용될 수 있음을 시사합니다. 또한, 혈관계와의 직접적인 접촉으로 인해이 장치는 뿌리 또는 표피 세포에 의해 효율적으로 흡수되지 않는 화합물을 테스트 할 수있는 기회를 제공 할 수도 있습니다. 특히 흥미로운 것은 RNA 간섭(RNAi)인데, 이는 숙주 식물, 병원체 또는 병원체 벡터 내에서 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 사과와 포도 식물의 줄기에 뚫린 구멍을 통해 헤어핀 RNA를 도입한 이전 연구에서는 RNA 분자가 목부 조직으로 제한되어 있으며, 이는 이러한 분자가 씹거나 목부 수액을 먹이는 유기체에만 효과적일 수 있음을 시사한다22. DPI 장치가 유사한 천공 전달 시스템을 사용한다는 점을 감안할 때 이 장치와 함께 전달되는 헤어핀 RNA도 목부 조직으로 제한될 수 있습니다. 그러나 DPI 장치에서 스트렙토마이신 치료 후 체관부 제한 CLas의 역가가 관찰된 것은 이 항생제가 체관부에 존재했음을 강력하게 시사합니다. 따라서 DPI 장치를 사용하여 전달되는 화합물의 혈관 분포는 크기와 화학에 따라 달라질 수 있으며 각 분자는 개별적으로 평가해야 합니다.

시중에 상업적으로 이용 가능한 많은 DPI 장치가 있지만 여기에 설명된 장치는 사내에서 제조할 수 있으며 수정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 사용되는 식물 종 및 실험 설계에 따라 크기의 개선 및 변경이 이루어질 수 있으며 상용 제품에 의존하지 않습니다. 또한, 이 장치는 식물에 반영구적으로 부착되어 있어 여러 화합물 주입으로 식물을 손상시킬 필요 없이 주어진 화합물의 다중 처리를 동시에 수행할 수 있습니다. 주의 사항으로 제대로 설치하지 않으면 장치가 누출될 수 있습니다. 결과적으로 화합물은 공장으로 전달되는 대신 환경으로 손실됩니다. 따라서 설정 중과 그 후 처음 며칠 동안 장치에 누출 징후가 있는지 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 나무에 구멍을 뚫는 것은 잠재적으로 해로울 수 있지만 이 방법은 견고하고 일관된 복합 흡수를 보장하기 위해 선택되었습니다. 또한, 이 실험에서 DPI 장치의 부착으로 인해 식물 건강에 대한 부작용이 나타나지 않았습니다. 그러나 주어진 실험 과정에서 활력을 잃을 수 있는 식물을 대체하기 위해 추가 식물을 실험 설계에 포함해야 합니다. 마지막으로, 이 장치는 수동 흐름을 사용하여 화합물을 도입하기 때문에 다른 식물 종 또는 동일한 종의 발달 단계에서 흡수 속도를 예측하기 어려울 수 있습니다. 화합물 흡수 속도가 제한 요인인 경우 실험이 복잡해질 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 식물이 최대 1주일이 소요될 수 있는 2.5mL의 화합물을 완전히 흡수할 수 있는 충분한 시간이 제공되도록 실험을 계획해야 합니다. 결론적으로, 이 DPI 장치는 CLas 및 그 매개체인 D. citri에 대한 항균 또는 살충 화합물의 질란 내 활성을 신속하게 평가하기 위한 효과적인 도구이며, 따라서 이전에 제시된 분리된 잎 분석보다 전신 효과 및 식물 성능에 대한 영향에 대한 더 많은 정보를 제공한다23. 의심할 여지 없이, 이 시스템의 다양한 응용 분야는 이 연구에서 설명한 특정 용도를 훨씬 뛰어넘습니다.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 이 연구에 사용된 식물에 대해 Mant Acon에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 자금은 미국 농무부(USDA) CRIS 프로젝트 8062-22410-007-000-D 및 USDA NIFA 보조금 2020-70029-33176에 의해 제공되었습니다.

Materials

0.5 cm Diameter Steel Balls Ballistic Products Inc. #SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe Becton Dickinson 382903029952
20 G 1 Syringe Needle Becton Dickinson 305175
2 mL Screw Cap Tubes USA Scientific 1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964077
3D Printer Markforged F-PR-2027
3D Printing Software Markforged F-SW-FDVX
3D Printing Software Markforged S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) Invitrogen C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964502
96 Well qPCR Machine Roche 5815916001
Centrifuge Eppendorf 22621408
Fluorescent Microscope Olympus SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter Chroma 69401-ET
Gloss Clear Spray Paint Rustoleum 249117
Grey Lego Baseplate Lego 11024
Handheld Cordless Drill Makita 6349D
Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163
Imidacloprid 2F Quali-Pro 83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness Fusion X Fishing Lures XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring Grainger Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray PAM 64144030217
NucleoSpin Plant II Macherey-Nagel 740770.5
Parafilm Bemis HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue Elmers E301
qPCR Master Mix Promega A6001
qPCR Primers Integrated DNA Technologies Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase Promega A5003
Single Edge Razor Blade Garvey 40475
Translucent Silicone RTV Rubber Aero Marine Products AM 115T
Transparent Silicone Tape Maxwell KE30S
Truncated Oncocin 112 Genscript Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece Lego 300901
White Nylon Markforged F-MF-0003
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Rhodes, B. H., Stange, R. R., Zagorski, P., Hentz, M. G., Niedz, R. P., Shatters, R. G., Pitino, M. Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants. J. Vis. Exp. (196), e65194, doi:10.3791/65194 (2023).
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