מכשיר עירוי ישיר להעברת מולקולות בצמחים
Summary
כתב יד זה מתאר מכשיר עירוי צמחי ישיר חדשני לבדיקת יעילותן של מולקולות כנגד החיידק (Candidatus Liberibacter asiaticus) או וקטור החרקים שלו (Diaphorina citri, Kuwayama) הקשורים בשילוב למחלת ההדרים Huanglongbing.
Abstract
בדיקת תפקודן של תרכובות טיפוליות בצמחים היא מרכיב חשוב במחקר החקלאי. שיטות פוליאריות וספוגות קרקע הן שגרתיות אך יש להן חסרונות, כולל ספיגה משתנה ופירוק סביבתי של מולקולות שנבדקו. הזרקת גזע של עצים מבוססת היטב, אך רוב השיטות לכך דורשות ציוד יקר וקנייני. כדי לסנן טיפולים שונים עבור Huanglongbing, יש צורך בשיטה פשוטה וזולה להעברת תרכובות אלה לרקמת כלי הדם של עצי הדר קטנים שגדלו בחממה הנגועים בחיידק המוגבל בפלואם Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) או שורצים בווקטור החרק CLas הניזון מפלואם Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
כדי לעמוד בדרישות סינון אלה, תוכנן מכשיר עירוי צמחים ישיר (DPI) המתחבר לגזע המפעל. המכשיר מיוצר באמצעות מערכת הדפסה תלת ממדית מבוססת ניילון ורכיבי עזר הניתנים להשגה בקלות. יעילות ספיגת התרכובת של מכשיר זה נבדקה בצמחי הדר באמצעות סמן פלואורסצנטי 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. פיזור אחיד של הסמן בכל הצמחים נצפה באופן שגרתי.
יתר על כן, מכשיר זה שימש כדי לספק מולקולות מיקרוביאליות וקוטלי חרקים כדי לקבוע את השפעתם על CLas ו – D. citri בהתאמה. הסטרפטומיצין האנטיביוטי של אמינוגליקוזיד הועבר לצמחי הדר נגועים ב-CLas באמצעות המכשיר, מה שהביא לירידה בטיטר CLas משבועיים ל-4 שבועות לאחר הטיפול. העברת קוטל החרקים הניאוניקוטינואיד אימידקלופריד לצמחי הדרים שורצי D. citri הביאה לעלייה משמעותית בתמותה של פסיליד לאחר 7 ימים. תוצאות אלה מצביעות על כך שהתקן DPI זה מייצג מערכת שימושית להעברת מולקולות לצמחים לצורך בדיקה ולהקל על מטרות מחקר וסינון.
Introduction
ניהול צמחים בסביבה מסחרית ונוף דורש לעתים קרובות שימוש בתרכובות כימיות כדי לייעל את צמיחת הצמח ובריאותו. האופן שבו מולקולות אלה מועברות תלוי בסוג המולקולה, בתפקוד המולקולה, בסוג הצמח ובמערכת הניהול הקיימת. יישומים פוליאריים ויישומי קרקע הם אסטרטגיות המסירה הקלות ביותר, אך מגבלות בספיגה של מולקולות מסוימות מחייבות העברה ישירה. דוגמה למולקולות אלה היא מולקולות טיפוליות המתפקדות בצורה הטובה ביותר כאשר הן נעות באופן מערכתי בתוך הצמח, אך אינן יכולות להיות מועברות ביעילות על ידי יישומים אקטואליים פשוטים1. זה המקרה עם Huanglongbing (HLB), המכונה גם מחלת הדר ירוק. HLB היא מחלה הקשורה לחיידק מוגבל פלואם, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), שלא ניתן לגדל בתרבית מחוץ לצמח, או לווקטור החרק שלו, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
אם המולקולות הטיפוליות המשוערות הן תוצרים גנטיים, ניתן לבדוק אותן על ידי יצירת צמחים טרנסגניים המבטאים תרכובות אלה. עם זאת, ייצור צמחים טרנסגניים יכול להיות עתיר זמן ומשאבים, תלוי מאוד בגנוטיפ, וניתן לעכב אותו על ידי השתקת גנים3. בנוסף, גם אם טרנסגניות אלה מראות תוצאות מבטיחות, אילוצי רגולציה ותפיסה ציבורית מפחיתים את הסיכוי לקבלתם המסחרית 4,5. היישום האקסוגני של תרכובות, לעומת זאת, מפשט את הבדיקה של מולקולות ביולוגיות וסינתטיות מכיוון שהוא אינו דורש ייצור של צמחים טרנסגניים יציבים או בעלי ביטוי חולף, מה שמקטין את הזמן והמשאבים לבדיקת השפעות המולקולה. שיטה לאספקה מערכתית יעילה ויעילה של תרכובות אקסוגניות יכולה לשמש למגוון רחב של מטרות מחקר וסינון.
אחד היישומים הללו הוא ניתוח של תנועת מולקולות מערכתיות בתוך מערכת כלי הדם של הצמח, אשר יכול להיעשות באמצעות סמנים הניתנים למעקב, בין אם הם פלואורסצנטיים, גלויים, או איזוטופים כימיים ייחודיים 6,7,8,9. סמן פלואורסצנטי נפוץ אחד הוא 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), שהוא צבע חדיר לקרום שמתפרק על ידי אסטראזות תוך-תאיות ל-5,6-carboxyfluorescein (CF) ולאחר מכן הופך לפלואורסצנטי ואטום-קרום10. CFDA נמצא בשימוש נרחב כדי לפקח על הובלת פלואם, יחסי כיור ומקור, ודפוסי כלי דם ברקמת צמח11,12.
בנוסף לסמנים אלה, תרכובות מסוימות עשויות לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של הצמח כדי להגדיל את התפוקה או להרוג את הצמח במקרה של קוטלי עשבים. גם קוטלי חרקים וגם תרכובות אנטי-מיקרוביאליות הם אמצעי להגדלת התפוקה של צמחים, במיוחד בנוכחות HLB. דוגמה למולקולה אנטי-מיקרוביאלית המשמשת לבקרת CLas היא סטרפטומיצין. סטרפטומיצין היא אנטיביוטיקה אמינוגליקוזידית שבודדה במקור מסטרפטומיצס גריסוס והוכחה כמעכבת צמיחת חיידקים באמצעות עיכוב של ביוסינתזה של חלבונים13. במונחים של קוטלי חרקים, היעד העיקרי למחקר HLB הוא D. citri, אשר מעביר CLas מעץ לעץ14. לשם כך משתמשים בדרך כלל בניאוניקוטינואידים, כגון אימידקלופריד, שכן הם תקן הזהב להדברת מזיקים15. כל השימושים המגוונים הללו הם היבטים חשובים של אסטרטגיות ניהול המפעל הנוכחיות, ופיתוח מוצרים חדשים תלוי בבדיקות סינון יעילות.
שיטה אחת המשמשת להחדרת תרכובות לצמחים עציים היא הזרקה ישירה לגזע. תוכננו מגוון מערכות המשתנות בצרכיהן באתרי הזרקה שנקדחו מראש, ומערכות אלה משתמשות בהזרקה מבוססת לחץ או בזרימה פסיבית16. למרות שמערכות מבוססות לחץ מאפשרות החדרה מהירה של תרכובת נתונה,יש לקחת בחשבון את הנזק הפיזי הפוטנציאלי שנגרם על ידי אילוץ נוזלים דרך כלי דם חסומים או תסחיפים. אף על פי שיישום העלווה או הספוג של תרכובות דורש פחות זמן ליישום, הזרקה ישירה של הצמח מפחיתה את בזבוז התרכובת הריבית עקב הפסדים לאוויר או לקרקע ויכולה גם להאריך את הזמן שבו תרכובות נמצאות במצב פעיל על ידי הפחתת החשיפה לסביבה החיצונית18. שני היבטים אלה חשובים לשימור ריאגנטים יקרים ולהבטחת עקביות בין משכפלים במסגרות מחקר.
מחקר זה מתאר את התכנון, הבנייה והשימוש במכשיר חדשני לעירוי צמחים ישיר (DPI), שניתן להשתמש בו כדי להעריך כיצד תרכובות עניין משפיעות על צמח מארח. מדפסת תלת ממד סטנדרטית שימשה לייצור המכשיר עצמו ומספר רכיבים הקשורים לבנייתו. שיטת בנייה פנימית זו מאפשרת לחוקרים לשנות את רכיבי המכשיר והמכשיר בהתבסס על צרכי הניסוי הספציפיים שלהם ומפחיתה את ההסתמכות על מכשירי הזרקת צמחים זמינים מסחרית. הגדרת המכשיר פשוטה ויעילה, וכל רכיבי העזר זמינים וזולים. למרות שהמערכת תוכננה לשימוש עם מגוון מיני צמחים, הדוגמאות המובאות כאן מתייחסות לעציצי הדרים. בנוסף, מחקר זה מדגים כי מכשיר זה מסוגל להעביר ביעילות סוגים רבים של תרכובות באופן מערכתי לצמחי הדר צעירים מבלי לגרום לקטלניות. התרכובות שנבדקו כללו CFDA, ששימש להערכת התפלגות התרכובות בצמח, וסטרפטומיצין ואימידקלופריד, ששימשו כדי לוודא שההשפעות האנטי-מיקרוביאליות וקוטלי החרקים של תרכובות אלה נצפו כאשר הועברו באמצעות DPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי שהתקן ה- DPI ייחשב לשיטה בת קיימא להעברת תרכובות אקסוגניות לצמחים, עליו לתרום לספיגת תרכובת חזקה ועקבית למגוון סוגי רקמות. הניסוי באמצעות CFDA הראה בבירור הן את תנועת התרכובת האקרופטלית והן את תנועת התרכובת הבזיפטלית, כמו גם במערכת כלי הדם ובתאי מזופיל של העלה. בנוסף, וככל הנראה מכיוון שהחור המשועמם המשמש במכשיר DPI זה מספק כמות גדולה של שטח פנים לספיגת תרכובות, CFDA היה נוכח בכמויות שוות יחסית בכל חלקי הגבעול, ולא רק בתת-קבוצה קטנה של כלי הדם הסמוכים למכשיר, כפי שנראה במחקרי ספיגת צבע קודמים בצמחים באמצעות הזרקת גזע6. בנוסף, נבדקה אספקת חלבון פלואורסצנטי ירוק וצבע פרחוני באמצעות מכשיר DPI, ונצפתה התפלגות של תרכובות אלה בדומה ל- CFDA (הנתונים אינם מוצגים). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש במכשיר כדי לספק באופן שיטתי מגוון תרכובות המשתנות בגודל ובמבנה המולקולרי. עם זאת, ראוי לציין כי היו הבדלים בספיגת התרכובת בהתבסס על שלב התפתחות העלים, כאשר עלים מתפתחים צעירים יותר תופסים יותר תרכובת מאשר עלים מבוססים מבוגרים יותר. זה יכול להיות בגלל השינויים בתכונות כלי הדם הקיימים ברקמת הכיור לעומת רקמת המקור ויש להתאים אותם לניסוי נתון.
מכשיר ה- DPI הראה ספיגה מספקת של תרכובת להדמיה של CFDA, GFP וצבע פרחים, והוא גם לקח מספיק כדי להראות את ההשפעות האנטיבקטריאליות וקוטלי החרקים של סטרפטומיצין ואימידקלופריד, בהתאמה. שתי תרכובות אלה הביאו לשינויים בכדאיות אורגניזם המטרה שבוע לאחר טיפול יחיד של 2.0 מ”ל. נתונים אלה מצביעים על כך שמכשיר ה- DPI יכול לשמש בבדיקות צמחים שלמים כדי לבדוק את הכדאיות של מגוון רחב של תרכובות להדברת מזיקים מיקרוביאליים וחרקים. יתר על כן, בשל המגע הישיר שלו עם מערכת כלי הדם, מכשיר זה עשוי אפילו לספק הזדמנות לבדוק תרכובות שאינן נלקחות ביעילות על ידי השורשים או תאי האפידרמיס. עניין מיוחד יהיה RNA interference (RNAi), שכן זה יכול לשמש כדי לווסת את ביטוי הגן בתוך הצמח המארח, פתוגן, או וקטור פתוגן. מחקרים קודמים שהכניסו רנ”א סיכות שיער דרך חור קדוח בגזע של צמחי תפוח וענבים הראו כי מולקולות הרנ”א היו מוגבלות לרקמת הקסילם, מה שמרמז על כך שמולקולות אלה עשויות להיות יעילות רק נגד אורגניזמים הניזונים מלשד לעיסה וקסילם22. בהתחשב בכך שמכשיר ה- DPI משתמש במערכת העברת חורים קדוחים דומה, סביר להניח כי RNA סיכת שיער המועבר עם מכשיר זה עשוי להיות מוגבל גם לרקמת הקסילם. עם זאת, הירידה שנצפתה בטיטר של CLas מוגבל פלואם לאחר טיפול סטרפטומיצין ממכשיר DPI מצביע מאוד על כך שאנטיביוטיקה זו הייתה נוכחת בפלואם. לכן, סביר להניח שפיזור כלי הדם של התרכובות המועברות באמצעות מכשיר ה- DPI תלוי בגודל ובכימיה שלהן, ויש להעריך כל מולקולה על בסיס אישי.
למרות שישנם מספר התקני DPI זמינים מסחרית הזמינים בשוק, המכשיר המתואר כאן יכול להיות מיוצר בבית וניתן לשינוי. בדרך זו, שיפורים ושינויים בגודל עשויים להתבצע על בסיס מיני הצמחים ועיצוב הניסוי בשימוש, והוא אינו מסתמך על מוצרים מסחריים. בנוסף, המכשיר מחובר באופן חצי קבוע לצמח, כלומר ניתן לבצע טיפולים מרובים בתרכובת נתונה במקביל ללא צורך לפצוע מחדש את הצמח בהזרקות מורכבות מרובות. בהערת אזהרה, המכשיר עלול לדלוף אם אינו מותקן כראוי. כתוצאה מכך, התרכובת אובדת לסביבה במקום להיות מועברת לצמח. לכן, יש להקפיד לבדוק את המכשיר לאיתור סימני דליפה במהלך ההתקנה ובימים הראשונים שלאחריה. למרות שקידוח חור בעץ עלול להזיק, שיטה זו נבחרה כדי להבטיח ספיגה חזקה ועקבית של התרכובת. בנוסף, לא נצפו השפעות שליליות על בריאות הצמח מחיבור מכשיר ה- DPI בניסויים אלה. עם זאת, צמחים נוספים צריכים להיכלל בתכנון הניסוי כדי להחליף את אלה שעלולים לאבד מרץ במהלך ניסוי נתון. לבסוף, מאחר שמכשיר זה משתמש בזרימה פסיבית כדי להציג תרכובות, קשה לחזות את קצב הספיגה של מיני צמחים שונים או שלבי התפתחות של אותו מין. זה עלול לסבך ניסויים אם מהירות ספיגת התרכובת היא גורם מגביל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ניסויים צריכים להיות מתוכננים כך מספיק זמן מסופק עבור הצמח לספוג באופן מלא את 2.5 מ”ל של תרכובת, אשר יכול להימשך עד 1 שבוע. לסיכום, מכשיר DPI זה הוא כלי יעיל להערכה מהירה של פעילות בצמח של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות או קוטלי חרקים כנגד CLas והווקטור שלו, D. citri, ובכך מספק מידע רב יותר על היעילות המערכתית וההשפעה על ביצועי הצמח מאשר בדיקת העלה המנותק23 שהוצגה קודם לכן. אין ספק, מגוון היישומים עבור מערכת זו מגיע הרבה מעבר לשימושים הספציפיים המתוארים במחקר זה.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למנט אקון על הצמחים ששימשו במחקר זה. המימון ניתן על ידי פרויקט CRIS 8062-22410-007-000-D של משרד החקלאות האמריקאי (USDA) ומענק NIFA של USDA 2020-70029-33176.
Materials
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
Riferimenti
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
