Angelman Sendromlu Bir Fare Modelinin Davranışsal Karakterizasyonu
Summary
Bu el yazması, bir Angelman sendromlu fare modelini doğrulamak için bir dizi yüksek oranda tekrarlanabilir davranış testi sunmaktadır.
Abstract
Bu makale, yerleşik bir fare AS’de Angelman sendromu (AS) benzeri fenotipleri karakterize etmek için mevcut olan bir dizi davranışsal testi açıklamaktadır. Hayvan motor bozukluklarını tespit etmek ve karakterize etmek için rotarod öğrenme paradigmasını, ayrıntılı yürüyüş analizini ve yuva kurma testini kullanıyoruz. Açık alanda hayvan duygusallığını ve yükseltilmiş artı labirent testlerinde ve ayrıca kuyruk süspansiyon testinde etkiyi test ediyoruz. AS fareleri açık alan testinde test edildiğinde, motor işlev bozuklukları labirentteki fare davranışını etkilediğinden ve aktivite puanlarını değiştirdiğinden sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır.
Sunulan davranış testlerinin tekrarlanabilirliği ve etkinliği, farklı nakavt varyantlarına sahip birkaç bağımsız Uba3a fare hattında zaten doğrulanmıştır ve bu test setini AS araştırmasında mükemmel bir doğrulama aracı olarak oluşturmuştur. İlgili yapıya ve yüz geçerliliğine sahip modeller, hastalığın patofizyolojisini aydınlatmak ve nedensel tedavilerin geliştirilmesini sağlamak için daha fazla araştırmayı garanti edecektir.
Introduction
Angelman sendromu (AS) nadir görülen nörogelişimsel bir hastalıktır. AS’nin en yaygın genetik kökeni, hastaların yaklaşık% 74’ünde bulunan maternal kaynaklı kromozomun 15q11-q13 bölgesinin büyük bir silinmesidir1. Bu bölgenin silinmesi, bir E3 ubikitin ligazını kodlayan AS’nin ana etken geni olan UBE3A’nın kaybına neden olur. Nöronlardaki UBE3A geninin baba aleli, damgalama olarak bilinen bir süreçte susturulur. Sonuç olarak, genin baba tarafından damgalanması, merkezi sinir sisteminde (CNS) yalnızca maternal ekspresyona izin verir2. Bu nedenle, maternal kaynaklı kromozomdan UBE3A gen delesyonu AS semptomlarının gelişmesine yol açar. İnsanlarda AS, tüm gelişim aşamaları boyunca devam eden ve etkilenen bireylerde ciddi zayıflatıcı semptomlarla sonuçlanan gelişimsel gerilik ile yaklaşık 6 aylıkken ortaya çıkar 3,4. Bozukluğun temel semptomları, sarsıntılı ataksik yürüyüş, ciddi konuşma bozukluğu ve zihinsel engellilik dahil olmak üzere ince ve kaba motor becerilerin eksikliğini içerir. AS hastalarının yaklaşık% 80’i uyku bozuklukları ve epilepsiden de muzdariptir. Bugüne kadar mevcut olan tek tedavi, epileptik nöbetleri azaltan ve uyku kalitesini artıran semptomatik ilaçlardır1. Bu nedenle, rafine fenotipleme analizinin yanı sıra tekrarlanabilir davranışsal fenotiplere sahip sağlam hayvan modellerinin geliştirilmesi, bozukluğun patofizyolojik mekanizmalarını aydınlatmak ve etkili ilaçları ve tedavileri keşfetmek için gerekli olacaktır.
CNS’yi etkileyen insan bozukluğunun karmaşıklığı, model organizmaların karşılaştırılabilir bir genom, fizyoloji ve davranışa sahip olmasını gerektirir. Fareler, kısa üreme döngüleri, küçük boyutları ve göreceli DNA modifikasyonu kolaylığı nedeniyle model organizma olarak popülerdir. 1984’te Paul Willner, üç temel hastalık modeli doğrulama kriteri önerdi: modelin değerini belirlemek için kullanılan yapı, yüz ve öngörücü geçerlilik5. Basitçe, yapı geçerliliği, bozukluğun gelişiminden sorumlu biyolojik mekanizmaları yansıtır, yüz geçerliliği semptomlarını özetler ve öngörücü geçerlilik, terapötik ilaçlara model yanıtını tanımlar.
Yukarıdaki ilkelere bağlı kalmak için, AS model fareler oluşturmak için UBE3A geni de dahil olmak üzere maternal 15q11.2-13q lokusunun büyük bir delesyonunu seçtik. CRISPR / Cas9 tekniğini, tüm UBE3A genini kapsayan, genin hem kodlayan hem de kodlamayan unsurlarını kapsayan, C57BL / 6N arka planındanfarelerde 76.225 bp uzunluğunda bir bölgeyi silmek için kullandık 6. Daha sonra UBE3A+/− heterozigot fareler elde etmek için hayvanları yetiştirdik. Modelin yüz doğrulaması için, UBE3A+/- döllerini (C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph olarak adlandırılan suş) elde etmek için UBE3A+/− dişilerden ve vahşi tip erkeklerden elde edilen hayvanları kullandık ve daha sonra UBE3A mGenedel/+ olarak atandık ve yavruları kontrol ettik. İnce ve kaba motor becerilerini, duygusallıklarını ve temel AS semptomlarını özetlemek için duygulanımlarını test ettik. Önceki bir makalede, AS hastaları da zihinsel engellilikten muzdarip olduğu için hayvanların bilişsel işlevlerini de değerlendirdik6. Bununla birlikte, UBE3AmGenedel / + farelerinde, belki de test7 sırasında hayvanların genç yaşı nedeniyle bilişsel bozukluk bulamadık. Daha sonra, yaklaşık 18 haftalık olan yaşlı hayvanların incelenmesi, yer tercihi paradigmasında tersine öğrenme sırasında davranışsal esneklikte bir eksiklik olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu analiz için kullanılan ekipmanın karmaşıklığı ayrı bir metodolojik modül gerektirir ve burada yer almaz.
Burada sunulan davranış testleri, yüksek prediktif değerleri ve yeterli yapı geçerliliğisayesinde genetik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan fenotipleme araçlarına aittir 8,9,10. Bu testleri, insan hastalığının temel semptomlarını tekrarlanabilir, yaştan bağımsız bir şekilde özetleyerek bir fare AS modelini doğrulamak için kullandık. Hayvanın duygusallığı, yükseltilmiş artı labirent ve açık alan testlerinde değerlendirildi. Bu testlerin her ikisi de, hayvanların yiyecek, barınak veya çiftleşme fırsatları aramak için yeni bir ortam keşfederken aynı zamanda anksiyojenik bölmelerden kaçındığı yaklaşma-kaçınma çatışmasına dayanmaktadır11. Ek olarak, açık alan testi bir farenin lokomotor aktivitesini test etmek için kullanılır8. Kuyruk süspansiyon testi, fare nakavt modellerinde yeni antidepresan ilaçları veya depresif benzeri fenotipleri taramak için depresyon araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır12. Bu test, hayvanların kaçınılmaz bir durumda zaman içinde geliştirdikleri umutsuzluğu değerlendirir. Motor öğrenme ve ayrıntılı yürüme özellikleri sırasıyla rotarod ve DigiGait’te belirlendi. Hızlanan çubuk üzerindeki hayvan dayanıklılığı, denge ve hareket koordinasyon becerilerini karakterize ederken, bir farenin adım modellerinin ayrıntılı analizi, birçok nörojeneratif hareket bozukluğuna bağlı nöromüsküler bozuklukların hassas bir değerlendirmesidir13,14,15. Yuva parçalama testi, kemirgenlerde dürtüsel davranışı tespit etmek için standart metodolojinin bir parçasıdır ve doğal kemirgen oluşturma davranışını kullandığından, hayvanın refahınıgösterir 16,17.
Deney gruplarının büyüklüğü, 3R kuralı taleplerini karşılamak ve koloni ıslah performansının verimli kullanımı için bir uzlaşmanın sonucuydu. Bununla birlikte, istatistiksel güç elde etmek için, yeterli miktarda üreme çiftinin kurulması nedeniyle grupların en az 10 bireyi vardı. Ne yazık ki, üreme performansı her zaman yeterli sayıda hayvanla sonuçlanmadı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklı fare suşlarında oluşturulan AS modelleri, insan semptomlarıyla karşılaştırmayı kolaylaştırmak için genellikle hayvanların duygusal durumu, motor işlevleri ve bilişsel yetenekleri testleriyle doğrulanır31,32. AS modellerinde motor eksikliği, laboratuvarlar arasında en tutarlı bulgudur, bunu mutantların değişmeyen duygusallık durumu ve yuva oluşturmada zorluklarizlemektedir 31,32,33<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Çek Bilimler Akademisi RVO 68378050, LM2018126 MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Çek Fenogenomik Merkezi’nin yükseltilmesi: MEYS ve ESIF tarafından çeviri araştırmalarına doğru geliştiriliyor), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (MEYS ve ESIF tarafından CCP Infrastructure Upgrade II) ve OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (MEYS ve ERDF tarafından transgenik modeller için daha yüksek kalite ve kapasite) tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından sağlanan “Gen Terapisi Derneği (ASGENT)”, Çekya (https://asgent.org/) ve Çek Fenogenomik Merkezi LM2023036 STK’sından fon almıştır.
Materials
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer – Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
Riferimenti
- Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
- Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
- Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
- Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
- Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
- Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
- Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
- Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
- Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
- Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
- La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
- Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
- Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
- Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
- Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
- Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
- Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
- Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
- File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
- Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
- Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
- Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
- Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
- Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).
