Angelman 증후군 마우스 모델의 행동 특성

Angelman 증후군 (AS)은 드문 신경 발달 질환입니다. AS의 가장 흔한 유전적 기원은 모계 유래 염색체의 15q11-q13 영역의 큰 결실이며, 이는 환자의 거의 74%에서 발견된다¹. 이 영역의 결실은 E3 유비퀴틴 리가제를 암호화하는 AS의 주요 원인 유전자인 UBE3A의 손실을 유발합니다. 뉴런에서 UBE3A 유전자의 부계 대립 유전자는 각인으로 알려진 과정에서 침묵합니다. 결과적으로, 유전자의 부계 각인은 중추 신경계 (CNS)에서 모계 발현 만 허용합니다 ². 따라서 모계 유래 염색체에서 UBE3A 유전자가 결실되면 AS 증상이 발생합니다. 인간의 경우, AS는 생후 6개월경에 나타나며, 발달 지연은 모든 발달 단계에 걸쳐 지속되며, 영향을 받은 개인에게 심각한 쇠약 증상을 초래한다 ^3,4. 이 장애의 핵심 증상에는 갑작스러운 운동 실조 보행, 심각한 언어 장애 및 지적 장애를 포함한 미세 및 대근육 운동 능력의 결핍이 포함됩니다. AS 환자의 약 80%는 또한 수면 장애 및 간질을 앓고 있습니다. 현재까지 유일하게 이용 가능한 치료법은 간질 발작을 줄이고 수면의 질을 향상시키는 증상 약물입니다¹. 따라서 정제된 표현형 분석과 함께 재현 가능한 행동 표현형을 가진 강력한 동물 모델의 개발은 장애의 병태생리학적 메커니즘을 밝히고 효과적인 약물 및 치료법을 발견하는 데 필수적입니다.

CNS에 영향을 미치는 인간 장애의 복잡성은 모델 유기체가 유사한 게놈, 생리학 및 행동을 소유할 것을 요구합니다. 마우스는 짧은 생식 주기, 작은 크기 및 DNA 변형의 상대적 용이성으로 인해 모델 유기체로 인기가 있습니다. 1984년, 폴 윌너(Paul Willner)는 모델의 값을 결정하는 데 사용되는 세 가지 기본 질병 모델 검증 기준, 구성, 얼굴 및 예측 타당도를 제안했다⁵. 간단히 말해서, 작제물 타당도는 장애 발생을 담당하는 생물학적 메카니즘을 반영하고, 얼굴 타당성은 그 증상을 요약하고, 예측 타당도는 치료 약물에 대한 모델 반응을 설명한다.

위의 원칙을 고수하기 위해 우리는 AS 모델 마우스를 만들기 위해 가장 일반적인 유전적 병인인 UBE3A 유전자를 포함한 모계 15q11.2-13q 유전자좌의 대규모 결실을 선택했습니다. 우리는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 C57BL/6N 배경의 마우스에서 유전자의 코딩 요소와 비코딩 요소를 모두 포함하는 전체 UBE3A 유전자에 걸쳐 있는 76,225bp 길이의 영역을 삭제했습니다⁶. 그런 다음 동물을 사육하여 UBE3A^+/- 이형접합체 마우스를 얻었습니다. 모델의 얼굴 검증을 위해 UBE3A+/- 암컷과 야생형 수컷의 교배된 동물을 사용하여 UBE3A^+/- 자손(C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph로 명명되고 나중에 UBE3A ^mGenedel/+로 할당됨) 및 대조군 새끼를 얻었습니다. 우리는 그들의 미세하고 총체적인 운동 능력, 감정 및 영향을 테스트하여 핵심 AS 증상을 요약했습니다. 이전 논문에서는 동물의 인지 기능도 평가했는데, AS 환자도 지적 장애를 앓고 있기 때문이다⁶. 그러나 UBE3A^mGenedel/+ 마우스에서 인지 장애는 발견되지 않았는데, 이는 아마도 실험 당시 동물의 나이가 어렸기 때문일 것입니다⁷. 나중에 18 주 된 나이 든 동물을 조사한 결과, 장소 선호 패러다임에서 반전 학습 동안 행동 유연성이 부족한 것으로 나타났습니다. 그러나 이 분석에 사용된 장비의 복잡성으로 인해 별도의 방법론 모듈이 필요하며 여기에는 포함되지 않습니다.

여기에 제시된 행동 테스트는 높은 예측 가치와 충분한 구성 타당도 ^8,9,10 덕분에 유전 연구에서 일반적인 표현형 도구에 속합니다. 우리는 이러한 테스트를 사용하여 재현 가능하고 연령에 구애받지 않는 방식으로 인간 질병의 핵심 증상을 요약하여 AS의 마우스 모델을 검증했습니다. 동물의 감정은 상승 플러스 미로 및 오픈 필드 테스트에서 평가되었습니다. 이 두 가지 테스트는 동물이 음식, 피난처 또는 짝짓기 기회를 찾기 위해 새로운 환경을 탐색하는 동시에 불안을 유발하는 구획을 피하는 접근 회피 갈등을 기반으로 합니다¹¹. 또한, 개방 필드 테스트는 마우스의 운동 활동을 테스트하기 위해 사용된다⁸. 꼬리 서스펜션 테스트는 마우스 녹아웃 모델¹²에서 새로운 항우울제 또는 우울 유사 표현형을 선별하기 위해 우울증 연구에서 널리 사용됩니다. 이 테스트는 피할 수 없는 상황에서 시간이 지남에 따라 동물이 발전하는 절망을 평가합니다. 운동 학습과 상세한 보행 특성은 각각 rotarod와 DigiGait에서 결정되었습니다. 가속 막대에 대한 동물의 지구력은 균형 및 운동 조정 기술을 특징 짓는 반면, 마우스의 단계 패턴에 대한 상세한 분석은 많은 신경 생성 운동 장애^13,14,15와 관련된 신경근 장애에 대한 민감한 평가입니다. 네슬렛 파쇄 테스트는 설치류의 충동적인 행동을 감지하기 위한 표준 방법론의 일부이며, 자연적인 설치류 형성 행동을 이용하기 때문에 동물의 웰빙을 나타냅니다^16,17.

실험군의 규모는 3R 규칙 요구 사항을 충족하기 위한 타협과 군체 육종 성능의 효율적인 사용의 결과였습니다. 그러나 통계적 검정력을 얻기 위해 그룹은 충분한 양의 번식 쌍을 확립했기 때문에 10 명 이상의 개체를 가졌습니다. 불행하게도, 번식 성과가 항상 충분한 수의 동물을 낳는 것은 아닙니다.