Gerichte micro-injectie en elektroporatie van cerebrale organoïden van primaten voor genetische modificatie

Het onderzoeken van de (patho)fysiologische ontwikkeling en evolutie van de hersenschors is een formidabele taak die wordt belemmerd door het ontbreken van geschikte modelsystemen. Voorheen waren dergelijke studies beperkt tot tweedimensionale celkweekmodellen (zoals primaire neurale voorloper- of neuronale celculturen) en evolutionair verre diermodellen (zoals knaagdieren)^1,2. Hoewel deze modellen nuttig zijn voor het beantwoorden van bepaalde vragen, zijn ze beperkt in het modelleren van de complexiteit, celtypesamenstelling, cellulaire architectuur en genexpressiepatronen van de zich ontwikkelende menselijke neocortex in gezonde en zieke toestanden. Deze beperkingen leiden bijvoorbeeld tot de slechte vertaalbaarheid van muismodellen van menselijke ziekten naar de menselijke situatie, zoals beschreven voor bepaalde gevallen van microcefalie (bijv. Zhang et ^al.3). Onlangs zijn transgene niet-menselijke primaten, die een evolutionair, functioneel en morfologisch dichterbij model van menselijke neocortexontwikkeling zijn, in beeld gekomen 4,5,6,7,8 omdat ze veel beperkingen van op celcultuur en knaagdieren gebaseerde modellen overwinnen. Het gebruik van niet-menselijke primaten in onderzoek is echter niet alleen zeer duur en tijdrovend, maar roept ook ethische bezwaren op. Meer recent is de ontwikkeling van hersenorganoïde technologie 9,10 naar voren gekomen als een veelbelovend alternatief dat veel van de beperkingen van eerdere modellen 11,12,13,14,15,16 oplost.

Hersenorganoïden zijn driedimensionale (3D), meercellige structuren die de belangrijkste kenmerken van de cytoarchitectuur en celtypesamenstelling van een of meerdere hersengebieden nabootsen voor een gedefinieerd ontwikkelingstijdvenster 11,12,13,14,17. Deze 3D-structuren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) of, indien beschikbaar voor de betrokken soort, uit embryonale stamcellen (SER’s). Over het algemeen kunnen twee soorten hersenorganoïden worden onderscheiden op basis van de gebruikte methodologie: ongeleide en geregionaliseerde (geleide) hersenorganoïden¹⁸. Bij het genereren van het laatste type organoïden worden kleine moleculen of factoren verstrekt die de differentiatie van de pluripotente stamcellen naar organoïden van een bepaald hersengebied (bijv. Voorhersenen organoïden) sturen)¹⁸. Bij ongeleide organoïden daarentegen wordt de differentiatie niet geleid door de toevoeging van kleine moleculen, maar berust deze uitsluitend op de spontane differentiatie van de iPSC’s/SER’s. De resulterende hersenorganoïden bestaan uit celtypen die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen (bijvoorbeeld cerebrale organoïden)¹⁸. Hersenorganoïden combineren veel belangrijke kenmerken van hersenontwikkeling met relatief kosten- en tijdefficiënte generatie van elke soort van belang waarvoor iPSC’s of SER’s beschikbaar zijn^11,12,13,14. Dit maakt hersenorganoïden een uitstekend model voor vele soorten neurobiologische studies, variërend van evolutionaire en ontwikkelingsvragen tot ziektemodellering en medicijntesten^15,16. Het beantwoorden van dergelijke vragen met behulp van hersenorganoïden hangt echter sterk af van de beschikbaarheid van verschillende methoden voor genetische modificatie.

Een belangrijk aspect van het bestuderen van neocortex (patho)fysiologische ontwikkeling en de evolutie ervan is de functionele analyse van genen en genvarianten. Dit wordt meestal bereikt door (ectopische) expressie en/of door knock-down (KD) of knock-out (KO) van die genen. Dergelijke genetische modificaties kunnen worden ingedeeld in stabiele en voorbijgaande genetische modificatie, evenals in de modificaties die tijdelijk en ruimtelijk beperkt zijn of niet beperkt zijn. Stabiele genetische modificatie wordt gedefinieerd door de introductie van een genetische verandering in het gastheergenoom die wordt doorgegeven aan alle volgende celgeneraties. Afhankelijk van het tijdstip van genetische modificatie kan het alle cellen van een organoïde beïnvloeden of kan het worden beperkt tot bepaalde celpopulaties. Meestal wordt stabiele genetische modificatie bereikt in hersenorganoïden op iPSC / ESC-niveau door lentivirussen, transposon-achtige systemen en de CRISPR / Cas9-technologie toe te passen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 en Teriyapirom et ^al.20). Dit heeft als voordeel dat alle cellen van de hersenorganoïde de genetische modificatie dragen en dat deze niet tijdelijk of ruimtelijk beperkt is. Het genereren en karakteriseren van deze stabiele iPSC/ESC-lijnen is echter zeer tijdrovend en duurt vaak enkele maanden voordat de eerste gemodificeerde hersenorganoïden kunnen worden geanalyseerd (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 of Teriyapirom et ^al.20).

Daarentegen wordt voorbijgaande genetische modificatie gedefinieerd door de levering van genetische lading (bijvoorbeeld een genexpressieplasmide) die niet integreert in het gastheergenoom. Hoewel deze modificatie in principe kan worden doorgegeven aan volgende celgeneraties, zal de geleverde genetische lading bij elke celdeling geleidelijk worden verdund. Daarom is dit type genetische modificatie meestal tijdelijk en ruimtelijk beperkt. Voorbijgaande genetische modificatie kan worden uitgevoerd in hersenorganoïden door adeno-geassocieerde virussen of door elektroporatie (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 en Teriyapirom et ^al.20), waarbij de laatste in detail wordt beschreven in dit artikel. In tegenstelling tot stabiele genetische modificatie is deze aanpak zeer snel en kostenefficiënt. Inderdaad, elektroporatie kan binnen enkele minuten worden uitgevoerd en, afhankelijk van de doelcelpopulatie (en), zijn geëlektroporeerde organoïden binnen enkele dagen klaar voor analyse (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et ^al.19). Grove morfologische veranderingen van de hersenorganoïde, zoals verschillen in grootte, kunnen echter niet worden gedetecteerd met deze methode, omdat dit type genetische modificatie tijdelijk en ruimtelijk beperkt is. Deze beperking kan ook een voordeel zijn, bijvoorbeeld in het geval van het bestuderen van individuele celpopulaties binnen de organoïde of de effecten op hersenorganoïden op specifieke ontwikkelingstijdstippen (beoordeeld door bijvoorbeeld Fischer et al.17 en Kyrousi et ^al.19).

Een klassieke benadering om de genfunctie tijdens de ontwikkeling en evolutie van de hersenen te bestuderen, is in utero-elektroporatie. In utero is elektroporatie een bekende en bruikbare techniek voor de afgifte van genexpressieconstructen in knaagdier 21,22,23 en fret ^24,25 hersenen. Ten eerste wordt een oplossing met de expressieconstructie(s) van belang micro-geïnjecteerd door de baarmoederwand in een bepaalde ventrikel van de embryonale hersenen, afhankelijk van het te richten gebied. In de tweede stap worden elektrische pulsen toegepast om de cellen direct langs de beoogde ventrikel te transfecteren. Deze benadering is niet alleen beperkt tot ectopische expressie of de overexpressie van genen, omdat het ook kan worden toegepast in KD- of KO-studies door micro-injecterende korte haarspeld (shRNA) of CRISPR / Cas9 (in de vorm van expressieplasmiden of ribonucleoproteïnen [RNP’s]), respectievelijk^26,27. De in utero elektroporatie van muizen-, ratten- en frettenembryo’s heeft echter dezelfde beperkingen als hierboven beschreven voor deze diermodellen.

Idealiter zou men in utero elektroporatie direct bij primaten willen uitvoeren. Hoewel dit in principe technisch mogelijk is, wordt elektroporatie in utero niet uitgevoerd bij primaten vanwege ethische overwegingen, hoge onderhoudskosten voor dieren en kleine worpgroottes. Voor bepaalde primaten, zoals mensapen (inclusief mensen), is dit helemaal niet mogelijk. Deze primaten hebben echter het grootste potentieel voor de studie van de menselijke (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan. Een oplossing voor dit dilemma is om de elektroporatietechniek toe te passen op primatenhersenorganoïden²⁸.

Dit artikel presenteert een protocol voor de elektroporatie van een subtype van primaat hersenorganoïden, primaten cerebrale organoïden. Deze aanpak maakt de snelle en kostenefficiënte genetische modificatie van celpopulaties binnen de ventrikelachtige structuren van de organoïden mogelijk. In het bijzonder beschrijven we een uniform protocol voor het genereren van cerebrale organoïden van primaten van menselijke (Homo sapiens), chimpansee (Pan troglodytes), resusaap (Macaca mulatta) en gewone marmoset (Callithrix jacchus) iPSC’s. Bovendien beschrijven we de micro-injectie- en elektroporatietechniek in detail en bieden we “go” en “no-go” -criteria voor het uitvoeren van cerebrale organoïde elektroporatie van primaten. Deze benadering is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van de (patho)fysiologische neocortexontwikkeling en de evolutie ervan in een model dat bijzonder dicht bij de menselijke situatie staat.