ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム
Summary
ここでは、ヒト細胞におけるジカウイルスの感染と複製をリアルタイムで研究するための非常に簡単で簡単な方法として、細胞ベースの電気インピーダンス(CEI)の使用を示します。さらに、CEIアッセイは抗ウイルス化合物の評価に有用である。
Abstract
セルベースの電気インピーダンス(CEI)技術は、電極が埋め込まれた培養プレートウェル上の接着細胞単層の成長または操作によって引き起こされるインピーダンスの変化を測定します。この技術は、ジカウイルス(ZIKV)感染と接着細胞複製の影響をリアルタイムで監視するために使用できます, このウイルスは非常に細胞病原性が高いため.これは、標識や侵襲的な方法の使用を必要とせず、リアルタイムデータを提供できるという利点がある簡単なアッセイです。ZIKV感染の動態は、使用する細胞株、ウイルス株、および感染多様性(MOI)に大きく依存しており、従来のエンドポイントアッセイでは簡単に研究することはできません。さらに、CEIアッセイは、抗ウイルス化合物の評価および特性評価にも使用でき、抗ウイルス化合物は感染過程にわたって動的な阻害特性も持つ可能性があります。この方法の記事では、CEIアッセイの実際の実行と、ZIKV研究および抗ウイルス研究全般におけるその潜在的な用途について詳細に説明します。
Introduction
ジカウイルス(ZIKV)の発生は、小頭症やギランバレー症候群などの重篤な疾患合併症に関連しています1,2,3。蚊媒介生物の分布の広がりや都市化の進展など、さまざまな危険因子により、将来の流行はもっともらしいですが、これまでのところ、ワクチンや抗ウイルス薬はまだ市場に出回っていません3,4。したがって、従来のZIKV研究方法は、このウイルスとその潜在的な抗ウイルス化合物を研究するための新しいツールで補完する必要があります。抗ウイルス研究は、多くの場合、表現型アッセイに基づいており、エンドポイントは、ウイルス誘発性細胞変性効果(CPE)の出現やレポーター遺伝子による特定のウイルス誘導タンパク質の産生などの特定のパラメータの存在です5,6,7。ただし、これらのメソッドにはエンドポイントの読み出しがあり、労働集約的であり、複雑な分析が必要になる場合があります。したがって、インピーダンスベースの方法は魅力的な代替手段を提供します。
セルベースの電気インピーダンス(CEI)は、電極含有ウェルに播種された接着セル層によって引き起こされる、ある電極から別の電極への電流の流れに対する抵抗として定義されます。この方法論で採用されている確立されたCEI技術は、もともとGiaeverとKeese 8,9によって開発された電気セル-基板インピーダンスセンシング(ECIS)です。これは、癌転移、毒物学、創傷治癒などの生物学的研究領域の幅広い分野で使用されています10、11、12。その原理は、周波数の範囲にわたって交流(AC)電圧を連続的に掃引することによって生成される電界に依存しています13。細胞は、これらの非侵襲的電界にばく露され、そして所定の間隔で、細胞増殖または細胞接着もしくは形態の変化によって引き起こされるインピーダンス変化が測定される14。さらに、細胞生存率の変化はインピーダンスの変化にもつながり、この技術は細胞病原性ウイルスの感染を監視するための有用なツールになります15,16,17。細胞層の形態変化をナノスケールで検出するため、高感度な検出ツールとなります。この記事に記載されているCEIアッセイは、細胞のインピーダンス変化を経時的に測定するための簡単で非侵襲的なリアルタイムのラベルフリーの方法です。
CEIは、ZIKV感染の経過またはその潜在的な抗ウイルス薬を評価するために使用されていませんが、診断ツールとしてのCEIの使用は18年以前に調査されています。最近の研究では、A549細胞におけるいくつかのZIKV阻害剤の抗ウイルス活性を決定するためのCEIアッセイの使用が初めて検証されました19。この方法の記事では、このCEIアッセイをより詳細に説明し、さまざまな接着細胞株、およびさまざまな感染多重度(MOI)でのさまざまなZIKV株に拡張します。これにより、フラビウイルス抗ウイルス研究におけるこの方法の多目的な使用が実証される。この方法は、リアルタイムの細胞モニタリングという決定的な利点を有し、重要な感染時点の検出および潜在的な抗ウイルス化合物による動的阻害活性を可能にする。まとめると、CEIテクノロジーは、現在の抗ウイルス方法論の範囲を補完する強力で価値のあるツールを提供します。
Protocol
記載されているすべてのステップは、バイオセーフティレベル2の実験室の層流キャビネット内で無菌条件下で実行されます。すべての使用済みウイルスは、ベルギーの治験審査委員会(Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, Protocol SBB 219 2011/0011)およびKUルーヴェンのバイオセーフティ委員会の規則に従って、承認済みとして取得され、使用されました。 1. 細胞培養の維持 注:このプロトコルは、選択した細胞株を使用して実行されますが、もちろん、細胞播種密度の最適化のみを必要とする、任意の接着細胞株に適合させることができます。 A549ヒト肺腺癌細胞株、U87ヒト悪性膠芽腫細胞株、およびHEL 299ヒト胚性肺線維芽細胞をT75培養フラスコ中で、加湿インキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で増殖させます。 細胞を80%〜95%のコンフルエントで継代培養する。すべての試薬は、細胞を培養する前に室温(RT)にする必要があります。 細胞から馴化培養液を取り除きます。5 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を使用して、細胞単層を1回洗浄します。 1 mLの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を細胞単層に均等に分配します。その後、細胞が剥離し始めるまで37°Cで最大3分間インキュベートします。 9 mLの新鮮な完全増殖培地を追加します(詳細については 、材料の表 を参照してください)。ピペットは細胞を再懸濁するために穏やかに上下に。 希望量の細胞懸濁液を新しいT75培養フラスコに移し、適量の新鮮な増殖培地を加えて、総容量15 mLを得ます。注:このプロトコルで使用される in vitro 細胞株は、理想的な増殖条件を可能にするために、特定の細胞株に応じて1:4〜1:10の希釈で継代培養されます。継代培養は3〜4日ごとに行われるため、望ましい細胞懸濁液量は、インキュベーション日数によっても変化します。 2. CEIプレートの準備 電極が挿入された96ウェルプレート( 材料表を参照)を取り、すべてのウェルに100 μLの成長培地を満たします。 ウェル間のスペースをDPBSで埋めます。注:これは、96ウェルプレートで細胞を培養するときに観察される蒸発によるエッジ効果を低減するために行われます。 プレートを5%CO2を含むインキュベーター内で37°Cで4時間インキュベートします。 3.細胞の播種 セクション1の説明に従って培養フラスコから細胞を剥離し、50 mLチューブ内の新鮮な増殖培地に再懸濁します。 選択した方法を使用して生細胞の数を数えます。注:A549細胞の場合、生存率は一般に~100%に達します。細胞数を決定するために、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色に基づく自動細胞分析システムを使用します( 材料表を参照)。他の細胞カウント方法も同様にうまく機能します。 細胞を新鮮な増殖培地に再懸濁して、所望の細胞密度を得る。この研究では、最適なA549細胞密度は0.15 ×10 6 (生存)細胞/ mLです。 電極が挿入された96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、マルチチャンネルピペットで培地を除去します。 1ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液(この場合は15×103 細胞に相当)を96ウェルプレートに分注します。 細胞を室温で15分間平衡化してから、CEIデバイスに入れます。 4. CEIアッセイのセットアップと実行 CEIデバイスプレートホルダーを収容するインキュベーターを37°C、5%CO2に置きます。 96ウェルプレートをデバイスに置きます。 デバイスのソフトウェアを開き、[データの収集] ウィンドウで [セットアップ] をクリックして新しい実験を設定します。ラップトップがECISデバイスに接続するのを待ち、ウェルのインピーダンスをチェックしてプレートを構成します。緑色で示されているように、すべてのウェルが正しく構成されているかどうかを確認してください。そうでない場合は、すべてのウェルが緑色になるまで手順4.2を繰り返します。 「Well 構成」ペインで、使用するカルチャーウェアに応じてアレイタイプを選択します。 複数の周波数/時間モードを選択します。注:このモードでは、デバイスは周波数範囲でのインピーダンス変化を測定します。 [開始] をクリックして測定を開始します。注意: リアルタイムインピーダンスは、ソフトウェアのインターフェイスで監視できます。表示する 周波数 を選択します。この例では、16 kHz が選択されています。 5. コンパウンドの調製とインキュベーション 注:抗ウイルス化合物の例として、ラビリントペプチンA1が使用されます( 材料の表を参照)。このプロトコルは、潜在的な抗ウイルス活性を有するすべての化合物に一般化することができるので、我々はそれを「化合物」と呼ぶ。 ウシ胎児血清(FBS)(「アッセイバッファー」と呼ぶ)を添加しずに完全な細胞培養培地をRTで平衡化させます。 化合物を氷上に置いてください。 5 mLポリプロピレンチューブ中のアッセイ培地中の各化合物の10倍濃縮希釈液を調製します。 アッセイ培地中の化合物を5 mLポリプロピレンチューブで段階希釈して、目的の10倍の濃度を得ます。 CEI デバイスを一時停止するには、[データ収集のセットアップ] ペインで [一時停止] をクリックします。現在の時点が完了するのを待ち、96ウェルプレートを取り出します。 光学顕微鏡下で細胞の接着と単層形成を確認します。 マルチチャンネルピペットで各ウェルから20 μLを除去します。 20 μLの化合物溶液またはビヒクルを目的のウェルに加えます。適切なピペッティングのための特定の条件でレイアウトを準備します。 プレートを5%CO2で37°Cで15分間インキュベートします。注:このインキュベーションステップには、CEIデバイスの代わりに通常のセルインキュベーターが使用されます。セルコントロール(CC)ウェルは、ビヒクル処理ウェルです。 6.ウイルスの準備と感染 ウイルスストックのバイアルを解凍します。この例では、ZIKV MR766 および ZIKV PRVABC59 が使用されています。 目的のMOIでウイルス希釈液を調製するか、15 mLポリプロピレンチューブ内のアッセイ培地で希釈します。注: この代表的な例では、MOI 0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.005、および 0.00005 が使用されています。 96ウェルプレートの割り当てられたウェルに100 μLのウイルス希釈液を追加します。アッセイ培地をCCウェルに追加します。 使用したウイルスコンテナを除染します。 プレートをCEIデバイスに戻し、[ 実験の再開]をクリックして6日間連続して測定を続行します。注:ウイルスコントロール(VC)ウェルはビヒクル処理された感染細胞ですが、CCウェルでは、ウイルス希釈の代わりにアッセイ培地が添加されます。化合物の細胞毒性が評価される場合は、ウイルス希釈の代わりに100 μLのアッセイバッファーを追加します。 7.データ分析 [完了] をクリックして実験を終了し、表示されるウィンドウに特定の実験条件に関する情報など、オプションの概要コメントを追加します。データ収集が完了したら [OK] をクリックします。 実験の最後にCCとVCの最大インピーダンス差が測定される グラフペイン で目的の周波数を選択します。最適な周波数を決定するには、感染していない細胞と感染した細胞でパイロット実験を実行し、感染細胞のインピーダンスがベースラインレベルに低下した時点で、感染していない細胞と感染した細胞の間で観測された最大のインピーダンス差につながる周波数を選択します。 ZIKVに感染したA549細胞の場合、これは 16kHzである。 すべてのデータをスプレッドシート形式でエクスポートするには、[ウェル 構成]ペイン ですべてのウェルが選択されていることを確認し、[ ファイル]、[データのエクスポート |グラフデータ。 すべてのデータポイントから実験の最後に測定された平均VCインピーダンス値を減算し、これを感染前に最後に測定された時点の平均CCインピーダンス値で割ることにより、データを正規化します。 正規化されたデータを時間関数でプロットして、CEIプロファイルグラフを取得します。 各条件の曲線下面積(AUCn)を計算して、50%阻害濃度(IC50)などのパラメータを決定する。 CIT50などの他の有用なパラメータを計算して、例えば、様々なウイルス株の感染力を比較する。
Representative Results
この記事では、ZIKV研究におけるCEIアッセイの使用について詳しく説明します。このアッセイのワークフローを図1に示します。所望の細胞型におけるZIKV感染のリアルタイムモニタリングの簡便性、および抗ウイルス化合物による感染阻害の評価を実証する。抗ウイルス剤として、我々はよく記述されたペプチドラビリントペプチンA1(Laby A1)を使用する。これを「化合物」と呼ぶのは、その特定の特性がこの方法の記事の範囲を超えており、他の場所で議論されているためです20,21。注目すべきことに、この方法の再現性については、この方法を使用して得られた個々のインピーダンスプロファイルに焦点を当てたいため、結果のセクションでは説明しません。ただし、これは以前に説明されています19。 最初の一連の実験では、CEI感染アッセイを実行する際の細胞密度の最適化の重要性を実証しました(図2)。播種される細胞が多すぎると、細胞単層は完全に成長し、CEI電極全体にさらに広がることができなくなります。これにより、CCとVCの差が小さくなり、分解能が低下し、抗ウイルス活性の検出ウィンドウが減少します。これは 、図2Eでよく例示されています。U87細胞などの特定の大きな細胞タイプでは、細胞を高密度に播種しすぎると、プレートを操作するときに細胞単層が完全に剥離することさえあります(図2F)。これも顕微鏡で観察されます。 図2はまた、このアッセイが細胞感受性研究の実施に非常に有用であることを実証している。図2A,Bから、感染動態は細胞型に大きく依存していることが明らかです。図2Cは、U87細胞が高MOIでのみZIKV感染の影響を受けやすいことを示しています。 2番目の実験セットでは、CEI感染アッセイの用途の広い使用が、さまざまなMOIで、よく説明されている抗ウイルス化合物の存在下で、さまざまなZIKV株を使用して強調されています(図3)。これらの実験は、フラビウイルス研究で一般的に使用されるモデルであるA549細胞を用いて行われる22,23。この細胞株は、CEIアッセイ24においてその適合性を実証した他の研究においても使用されている。まず、アフリカ系統の代表的なZIKV株であるMR766による感染動態を、アジア系統のPRVABC59のものと比較する。図3Aは、両方の株が同等のCEIパターンを有し、PRVABC59がわずかに遅いCPE誘導特性を有することを示している。これは、CIT50の値にも反映されています(図3B)。この興味深いパラメータは、Fangら16によって最初に導入され、CEI測定の動力学を考慮に入れています。これは、セル制御と比較してインピーダンスを50%低減するのに必要な時間として定義されます。 次に、細胞をZIKV MR766またはPRVABC59のいずれかの3つの異なるMOIに、さまざまな化合物濃度の存在下または非存在下で感染させ、インピーダンスプロファイルをモニターしました。図3C−Hから観察できるように、特定の化合物濃度は、ZIKV感染によって引き起こされるインピーダンス低下を阻害または遅延させる。これは、AUC 値が計算されるときにも反映されます。CEIアッセイの結果はまた、抗ウイルス活性がMOIおよび効力評価の時点に依存することを視覚的に示している。AUCnの計算を使用して、図3Iに示すようにIC50値を決定することができます。最後に、図3Hは、CIT50値を使用して化合物の効力を決定および比較することもできることを示しています。不活性化合物または化合物濃度は、VCに匹敵するCEIプロファイル、AUC、およびCIT50値によって特徴付けられます。 図1:アッセイのワークフローの概略図。 CEIアッセイのタイムラインとさまざまな取り扱いおよびインキュベーションステップがここに示されています。略語:CEI =セルベースの電気インピーダンス。ZIKV = ジカウイルス;D =日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:異なる密度でのZIKV感染細胞の正規化されたCEIプロファイル。 (A,D)A549、(B,E)HEL 299、または(C,F)U87細胞を、96ウェルCEIプレートに(A-C)15,000〜20,000(「最適」)または(D-F)75,000(「準最適」)細胞で播種した。インピーダンスモニタリングの24時間後、細胞をZIKV MR766の10倍MOI希釈液で感染させた。インピーダンスはさらに5日間連続して監視した。代表的な実験のCEIプロファイル(2つの技術反復の平均±範囲)を示す。略語:CEI =セルベースの電気インピーダンス。MOI =感染の多様性;ZIKV = ジカウイルス;ノルム=正規化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:2つのZIKV株による感染および抗ウイルス化合物による阻害後のA549細胞の正規化されたCEIプロファイル。 (A)接着A549細胞にZIKV MR766またはZIKV PRVABC59のいずれかのさまざまなMOIを感染させ、インピーダンスを継続的に監視しました。代表的な実験の3つの技術反復の平均±SDが示されている。(B)CIT50値は、AのCEIプロファイルに基づいて計算され、比較されました。実行された3つのテクニカル反復の平均±SDが示されています。(C-H)接着性A549細胞を様々な化合物濃度で処理し、続いてZIKV MR766(C−E)またはZIKV PRVABC59(F−H)のいずれかの特異的MOIで感染させた。インピーダンスは継続的に監視されました。代表的な実験の2つの技術反復の平均±範囲が示されている。(i)異なるZIKV株および希釈液に対する化合物阻害を比較するために、AUC nを計算し、すべての条件をCC AUC nで減算し、VC AUCnで割ることによって阻害率を決定した。(J)C−Hで示される実験のCIT50値を、異なるZIKV株およびMOIを比較するために計算した。2つのテクニカル反復の平均±範囲が示されています。略語:CEI =セルベースの電気インピーダンス。MOI =感染の多様性;ZIKV = ジカウイルス;ノルム=正規化。CIT 50 =未処理の制御と比較してインピーダンスが50%減少した時間。AUC =曲線の下の面積。CC =セル制御;VC = ウイルス制御。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
この記事では、ZIKV抗ウイルス研究におけるCEIアッセイの使用について説明します。このアッセイにはリアルタイムモニタリングの利点があるため、選択的化合物によるZIKV感染および抗ウイルス阻害の動態を評価するために使用できます。この方法で得られたデータは、ウイルス誘発性CPEおよび潜在的な抗ウイルス化合物の効力の客観的かつ視覚的観察を可能にする。
CEIは非常に感度の高い方法であるため、この細胞アッセイを実行する際には細心の注意を払う必要があります。ピペッティングのばらつきをできるだけ避けるために、正確なピペッティングを行うことが重要です。さらに、細胞数や使用済みウイルスストックなど、実験結果に影響を与える可能性のある他の要因は、実験の繰り返し間で一定に保つ必要があります。これらは、細胞の成長と感染の速度に大きく影響する要因であるため、計算されたCIT50 値やその他のパラメーターの変動につながる可能性があります。
(潜在的な)抗ウイルス化合物の存在下でCEIアッセイを実施する場合、それらがウイルスの非存在下で細胞のインピーダンスに影響を与えるかどうかを判断することが重要です。この技術は非常に感度が高いため、インピーダンスの変化は化合物の細胞毒性濃度19をはるかに下回って測定される可能性があります。
この記事ではZIKVデータのみを示していますが、このアッセイは、最適なCEIモニタリング頻度の決定など、最小限の最適化作業で、他の細胞病原性(フラビ)ウイルスに簡単に適用できます。CEIアッセイの適応は、チクングニア、インフルエンザA、ヒトおよびウマヘルペスウイルスなどのさまざまなヒトおよび動物ウイルスで採用されています25,26,27,28。ここでは、ウイルス力価の定量や抗ウイルス化合物の同定のための簡単な方法としても使用されます。これらの研究では、CEIの代替方法であるリアルタイム細胞分析を使用しました。
CEI技術の使用は、アッセイの原理が電極埋め込みウェル全体に広がる接着細胞の特性に依存しているため、接着細胞タイプに限定されています。フィブロネクチンなどのウェル表面コーティングは、細胞付着を改善するために使用することができる29。この方法論には他にもいくつかの欠点があり、最初の欠点はそのコストに関連しています。CEI監視装置とそれに付随するハードウェアおよびソフトウェアへの投資とは別に、消耗品もやや高価です。さらに、このプロトコルではウイルス感染を数日間監視する必要があるため、週に1枚の96ウェルプレートを評価できます。高コストと相まって、これは使用を低から中程度のスループット設定に制限します。
これらのスループットの問題のため、この技術は抗ウイルススクリーニングの設定には適していません。ただし、特定の疾患関連環境でのZIKV感染の研究のための細胞感受性を評価する場合など、初期の実験段階では非常に魅力的です。この技術は、トランスフェクトまたはノックアウト細胞株でも有用であり、例えば、特定の侵入受容体の有無にかかわらず、感染動態の変化を容易に観察することができます。これは、ZIKV感染における細胞因子の関与を調査するときに興味深いものです。さらに、後の前臨床段階で、特定のリード候補が選択されている場合、CEIアッセイを使用して、選択された化合物のさらなる詳細な特性評価を行うことができます。CEIバイオセンサは、ウイルス18の検出のために、ウイルス特異的抗体などの特定の生体認識要素を固定化することによって修飾することもできる。全体として、これはウイルス学の設定におけるCEIの多様な使用を浮き彫りにします。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿を校正してくれたClément HeymannとGorrit Lootsmaに感謝します。この研究は、ウイルス学および化学療法研究所(レガ研究所、KUルーヴェン)の内部助成金によって支援されました。
Materials
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
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Citazione di questo articolo
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