ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

ליפופרוטאינים דיסקואידים בצפיפות גבוהה (HDLs) הם אבות טבעיים של HDL כדורי הרבה יותר נפוץ הקיים במערכת הדם האנושית. חלקיקים חדשים אלה, המכונים גם pre-ß HDL, הם בעלי תכונות מבניות ייחודיות וייחודיות¹. ואכן, במקום להתקיים כחלקיק כדורי, HDL מתהווה הוא בצורת דיסק. מחקרי אפיון מבניים נרחבים על HDL דיסקואידים טבעיים ומשוחזרים גילו כי הם מורכבים מדו-שכבה פוספוליפידית שהיקפה מוקפת על ידי אפוליפופרוטאין אמפיפתי הניתן להחלפה (apo), כגון apoA-I. במטבוליזם של ליפופרוטאינים אנושיים, HDLs מתהווים במחזור צוברים שומנים מתאים היקפיים ומבשילים ל-HDL כדוריים בתהליך התלוי במתווכי חלבונים מרכזיים, כולל מעביר קלטות קושר ATP A1 ולציטין:כולסטרול אצילטרנספראז². תהליך זה מהווה מרכיב קריטי במסלול העברת כולסטרול הפוך שנחשב כמגן מפני מחלות לב. חמושים בידע זה וביכולת לשחזר HDL דיסקואידלי, חוקרים השתמשו בחלקיקים אלה כהתערבות טיפולית לטיפול בטרשת עורקים³. בעיקרו של דבר, עירוי של HDL משוחזר (rHDL) לחולים מקדם את שטף הכולסטרול ממשקעי פלאק ומחזיר אותו לכבד לצורך המרה לחומצות מרה והפרשת מהגוף. מספר חברות ביוטכנולוגיה / תרופות נוקטות באסטרטגיית טיפול זו⁴.

במקביל, היכולת לייצר חלקיקים אלה במעבדה עוררה גל של פעילויות מחקר שהובילו ליישומים חדשים וטכנולוגיות חדשות. יישום בולט אחד כולל שימוש בחלקיקי rHDL כקרום מיניאטורי כדי לאכלס חלבונים טרנסממברנליים בסביבה דמוית ילידים⁵. עד כה, מאות חלבונים שולבו בהצלחה ב-rHDL דיסקואידלי, ומחקרים הוכיחו כי חלבונים אלה שומרים הן על קונפורמציה טבעית והן על פעילות ביולוגית כקולטנים, אנזימים, טרנספורטרים וכו’. חלקיקים אלה, המכונים “ננודיסקים”, הוכחו גם כמתאימים לאפיון מבני, לעתים קרובות ברזולוציה גבוהה⁶. גישה זו לחקירות של חלבונים טרנסממברנליים מוכרת כעדיפה על מחקרים עם מיצלות דטרגנטים או ליפוזומים, וכתוצאה מכך, היא מתקדמת במהירות. חשוב להכיר בכך שדווחו שתי שיטות שונות המסוגלות ליצור rHDL. שיטת “דיאליזה כולאט”¹³ פופולרית ליישומים הקשורים לשילוב חלבונים טרנסממברנליים בשכבה הדו-שכבתית^{rHDL 5}. בעיקרו של דבר, שיטת ניסוח זו כוללת ערבוב של פוספוליפיד דו-שכבתי היוצר פוספוליפיד, חלבון פיגום והחלבון הטרנסממברנה המעניין במאגר המכיל את חומר הניקוי נתרן כולאט (או נתרן דאוקסיכולאט; משקל מולקולרי של מיצלה [MW] של 4,200 Da). חומר הניקוי מסיס ביעילות את מרכיבי התגובה השונים, ומאפשר לדגימה להיות מחוייגת כנגד חיץ חסר חומר ניקוי. במהלך שלב הדיאליזה, כאשר חומר הניקוי מוסר מהדגימה, נוצר rHDL באופן ספונטני. כאשר משתמשים בגישה זו כדי ללכוד חלבון טרנסממברנה מעניין, חלקיקי המוצר כונו ננודיסקים⁵. ניסיונות להשתמש בשיטה זו כדי לשלב חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים של מולקולות קטנות (MW <1,000 Da), עם זאת, לא צלחו ברובם. שלא כמו חלבונים טרנסממברנליים, חומרים ביו-אקטיביים של מולקולות קטנות מסוגלים לברוח משקית הדיאליזה יחד עם חומר הניקוי, מה שמקטין מאוד את יעילות השילוב שלהם ב-rHDLs. בעיה זו נפתרה על ידי השמטת חומרי ניקוי מתערובת הפורמולציה¹⁴. במקום זאת, הרכיבים מתווספים למאגר מימי ברצף, החל מהשכבה הדו-שכבתית היוצרת שומנים, ויוצרים סוכן ביו-אקטיבי יציב המכיל rHDL, המכונה ננודיסק. אחרים השתמשו ב-rHDL לשילוב והובלה של חומרי הדמיה in vivo ⁷. לאחרונה, rHDL מיוחד המורכב מפיגום אפוליפופרוטאין והגליצרופוספוליפיד האניוני, קרדיוליפין, שימשו במחקרי קשירת ליגנדים. חלקיקים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים על האינטראקציה של cardiolipin עם ליגנדות מסיסים במים שונים, כולל סידן, cytochrome c, ואת סוכן אנטי סרטני doxorubicin⁸.

המחקר הנוכחי מתמקד בניסוח rHDL בעל חומר ביו-אקטיבי הידרופובי משולב יציב (כלומר ננודיסק). היכולת של חומרים אלה להשתלב בסביבה השומנית של חלקיקי rHDL דיסקואידים מעניקה להם ביעילות מסיסות מימית. ככאלה, לננודיסקים יש פוטנציאל ליישומים טיפוליים in vivo . בעת גיבוש ננו-דיסקים, נדרשים תנאי דגירה/תגובה ספציפיים כדי לשלב בהצלחה חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים בדידים בחלקיק המוצר, ומטרת דוח זה היא לספק מידע מעשי מפורט שיכול לשמש כתבנית בסיסית ליצירת חלקיקי ננו-דיסק חדשניים עבור יישומים ספציפיים. לפיכך, בהקשר של כתב יד זה המונחים ננודיסק וננודיסק אינם ניתנים להחלפה. בעוד שננודיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח להכיל חלבון טרנסממברנה המוטבע^בשכבה הדו-שכבתית 5 של השומנים, המונח ננו-דיסק מתייחס ל-rHDL שנוסח לשלב משקל מולקולרי נמוך (< 1,000 Da) חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים, כגון אמפוטריצין B¹⁴.

קיימות מגוון שיטות לרכישת חלבוני פיגומים מתאימים. ניתן לרכוש חלבוני פיגומים מיצרנים [למשל apoA-I (SRP4693) או apoE4 (A3234)], אולם העלות עשויה להיות גורם מגביל. גישה מועדפת היא לבטא חלבוני פיגום רקומביננטיים ב– Escherichia coli. פרוטוקולים מתפרסמים עבור apoA-I⁹, apoE4¹⁰ אנושי, כמו גם חלבון המולימפה אפוליפופורין-III¹¹. לצורך הניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בדומיין רקומביננטי אנושי מסוג apoE4 N-terminal (NT) (חומצות אמינו 1-183). רצף הנוקלאוטידים המקודד apoE4-NT האנושי סונתז והוכנס לווקטור ביטוי pET-22b (+) הסמוך ישירות לרצף מובילי pelB המקודד על ידי וקטור. מבנה זה מוביל לביטוי של חלבון היתוך מוביל pelB – apoE4-NT. לאחר סינתזת חלבונים, רצף מובילי pelB חיידקי מכוון את החלבון החדש המסונתז לחלל הפריפלסמי שבו פפטידאז מוביל חותך את רצף pelB. חלבון apoE4-NT המתקבל, ללא תגי רצף או זנבות, בורח לאחר מכן מהחיידקים ומצטבר בתווך התרבית^11,12, מה שמפשט את העיבוד במורד הזרם.