Formulation et caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques

Les lipoprotéines discoïdales naissantes de haute densité (HDL) sont des progéniteurs naturels du HDL sphérique beaucoup plus abondant présent dans le système circulatoire humain. Ces particules naissantes, également appelées pré-ß HDL, possèdent des propriétés structurelles uniques et distinctives¹. En effet, plutôt que d’exister sous forme de particule sphéroïdale, les HDL naissants sont en forme de disque. Des études approfondies de caractérisation structurale sur les HDL discoïdaux naturels et reconstitués ont révélé qu’ils sont constitués d’une bicouche phospholipide dont le périmètre est circonscrit par une apolipoprotéine échangeable amphipathique (apo), telle que l’apoA-I. Dans le métabolisme des lipoprotéines humaines, les HDL naissants circulants accumulent des lipides des cellules périphériques et mûrissent en HDL sphériques dans un processus qui dépend de médiateurs protéiques clés, y compris le transporteur de cassette de liaison ATP A1 et l’acyltransférse lécithine:cholestérol². Ce processus représente un élément essentiel de la voie de transport inverse du cholestérol qui est considérée comme protectrice contre les maladies cardiaques. Forts de ces connaissances et de la capacité de reconstituer les HDL discoïdaux, les chercheurs ont utilisé ces particules comme intervention thérapeutique pour traiter l’athérosclérose³. En substance, la perfusion de HDL reconstitué (rHDL) chez les patients favorise l’efflux de cholestérol des dépôts de plaque et le renvoie au foie pour la conversion en acides biliaires et l’excrétion du corps. Plusieurs sociétés biotechnologiques/pharmaceutiques poursuivent cette stratégie de traitement⁴.

Dans le même temps, la capacité de générer ces particules en laboratoire a déclenché une vague d’activités de recherche qui ont conduit à de nouvelles applications et à de nouvelles technologies. Une application importante implique l’utilisation de particules rHDL comme membrane miniature pour abriter des protéines transmembranaires dans un environnement de type natif⁵. À ce jour, des centaines de protéines ont été incorporées avec succès dans le rHDL discoïdal, et la recherche a démontré que ces protéines conservent à la fois la conformation native et l’activité biologique en tant que récepteurs, enzymes, transporteurs, etc. Ces particules, appelées « nanodisques », se sont également révélées se prêtant à une caractérisation structurale, souvent à haute résolution⁶. Cette approche des recherches sur les protéines transmembranaires est reconnue comme supérieure aux études sur les micelles ou les liposomes de détergent et, par conséquent, progresse rapidement. Il est important de reconnaître que deux méthodes distinctes ont été rapportées qui sont capables de former un rHDL. La méthode de « dialyse au cholate »¹³ est populaire pour les applications liées à l’incorporation de protéines transmembranaires dans la bicouche^{rHDL 5}. Essentiellement, cette méthode de formulation consiste à mélanger un phospholipide formant une bicouche, une protéine d’échafaudage et la protéine transmembranaire d’intérêt dans un tampon contenant le détergent cholate de sodium (ou désoxycholate de sodium; masse moléculaire micelle [MW] de 4 200 Da). Le détergent solubilise efficacement les différents composants de la réaction, ce qui permet de dialyser l’échantillon contre un tampon détergent. Pendant l’étape de dialyse, lorsque le détergent est retiré de l’échantillon, un rHDL se forme spontanément. Lorsque cette approche est utilisée pour piéger une protéine transmembranaire d’intérêt, les particules de produit ont été appelées nanodisques⁵. Les tentatives d’utilisation de cette méthode pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes à petites molécules (MW <1 000 Da), cependant, ont été largement infructueuses. Contrairement aux protéines transmembranaires, les agents bioactifs à petites molécules sont capables de s’échapper du sac de dialyse avec le détergent, ce qui diminue considérablement leur efficacité d’incorporation dans les rHDL. Ce problème a été résolu en omettant les détergents du mélange de formulation¹⁴. Au lieu de cela, les composants sont ajoutés séquentiellement à un tampon aqueux, en commençant par la bicouche formant un lipide, formant un agent bioactif stable contenant du rHDL, appelé nanodisque. D’autres ont utilisé le rHDL pour l’incorporation et le transport d’agents d’imagerie in vivo ⁷. Plus récemment, des rHDL spécialisés composés d’un échafaudage d’apolipoprotéines et du glycérophospholipide anionique, la cardiolipine, ont été utilisés dans des études de liaison aux ligands. Ces particules fournissent une plate-forme pour des études de l’interaction de la cardiolipine avec divers ligands solubles dans l’eau, y compris le calcium, le cytochrome c et l’agent anticancéreux doxorubicine⁸.

La présente étude est axée sur la formulation de rHDL qui possèdent un agent bioactif hydrophobe incorporé de manière stable (c.-à-d. nanodisque). La capacité de ces agents à s’intégrer dans le milieu lipidique des particules discoïdales de rHDL leur confère efficacement une solubilité aqueuse. En tant que tels, les nanodisques ont le potentiel pour des applications thérapeutiques in vivo . Lors de la formulation de nanodisques, des conditions d’incubation / réaction spécifiques sont nécessaires pour incorporer avec succès des agents bioactifs hydrophobes discrets dans la particule du produit, et l’objectif de ce rapport est de fournir des informations pratiques détaillées qui peuvent être utilisées comme modèle fondamental pour la création de nouvelles particules de nanodisques pour des applications spécifiques. Ainsi, dans le contexte de ce manuscrit, les termes nanodisque et nanodisque ne sont pas interchangeables. Alors que nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour contenir une protéine transmembranaire intégrée dans sa bicouche lipidique⁵, le terme nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes de faible poids moléculaire (< 1 000 Da), tels que l’amphotéricine B¹⁴.

Diverses méthodes sont disponibles pour l’acquisition de protéines d’échafaudage appropriées. Il est possible d’acheter des protéines d’échafaudage auprès de fabricants [par exemple, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], mais le coût peut être un facteur limitant. Une approche privilégiée consiste à exprimer des protéines d’échafaudage recombinantes dans Escherichia coli. Des protocoles sont publiés pour l’apoA-I 9⁹, l’apoE4¹⁰ humaine, ainsi que pour la protéine d’hémolymphe d’insecte apolipophorin-III¹¹. Pour les besoins des expériences décrites ici, le domaine N-terminal (NT) apoE4 humain recombinant (acides aminés 1-183) a été utilisé. La séquence nucléotidique codant pour l’apoE4-NT humain a été synthétisée et insérée dans un vecteur d’expression pET-22b (+) directement adjacent à la séquence de tête pelB codée par le vecteur. Cette construction conduit à l’expression d’une protéine de fusion pelB leader-apoE4-NT. Après la synthèse des protéines, la séquence de tête pelB bactérienne dirige la protéine nouvellement synthétisée vers l’espace périplasmique où la peptidase leader clive la séquence pelB. La protéine apoE4-NT résultante, sans marqueurs de séquence ni queues, échappe ensuite aux bactéries et s’accumule dans le milieu^{de culture 11,12,} simplifiant le traitement en aval.