Çok Kuyulu Mikroelektrot Dizilerinde İnsan İn Vitro Nöral Kültürlerinin Odaklanmış Ultrason Nöromodülasyonu

Fokuslu ultrason (FUS), milimetre altı çözünürlük ^1,2,3 ile santimetre düzeyinde derinliklerde noninvaziv stimülasyon sağlayan umut verici bir nöromodülasyon yöntemidir. Bu güçlü yönlere rağmen, FUS'un klinik etkisi, kısmen etki mekanizması ile ilgili bilgi eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Sağlam bir teorik temel olmadan, araştırmacılar ve klinisyenler, tedaviyi değişen koşullar altında bireysel hastaların özel ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde uyarlamada zorluklarla karşılaşırlar. Yoo ve ^ark.4 tarafından önerilen önemli bir teori, mekanosensitif iyon kanallarının nöron aktivasyonundan sorumlu olduğunu öne sürmektedir. Bununla birlikte, bu teori, bu kanallardan yoksun olan insan beyni nöronlarındaki FUS aktivasyonunu açıklayamamaktadır⁵. Bu belirsizlik, tedavi sonuçlarını optimize etmek için FUS parametrelerinin ayarlanmasını engellediği için klinikte FUS kullanımını sınırlar.

Önceki ilgili çalışmalar, FUS'u destekleyen fizyolojik mekanizmaları araştırmak ve optimal stimülasyon parametrelerini belirlemek için bir dizi yaklaşım kullanmıştır. Bu süreçteki önemli bir adım, kalsiyum iyonu görüntüleme⁴, optik görüntüleme¹ ve ex vivo elektrofizyolojik kayıt (örneğin, elektromiyografi⁶ veya deri-sinir elektrofizyolojisi⁷) gibi iyon kapısı izlemeyi içeren yöntemlerle elde edilebilen nöronal yanıtların geri bildirim olarak izlenmesini içerir. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu, insan olmayan nöronları veya in vivo yaklaşımları kullanır ve bu da optimal olmayan kontroller nedeniyle ek varyanslar ortaya çıkarabilir. Buna karşılık, in vitro insan kaynaklı pluripotent kök hücre (HiPSC) nöronlarındaki nöronal sinyalleri ölçmek için elektrotların kullanılması, daha hassas ölçümler ve deneysel ortam üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Bu çalışmada, Şekil 1'de gösterildiği gibi, FUS stimülasyonunu takiben HiPSC nöronlarının elektriksel tepkilerini ölçmek için mikro elektrot dizileri (MEA'lar) kullanılarak bir in vitro sistem geliştirilmiştir. Bu sistem, topluluktaki araştırmacılara, ultrason parametrelerini (örneğin, frekans, patlama uzunluğu, yoğunluk) değiştirirken nöronal tepkileri izleme yetkisi verir. Ek olarak, bu sistem, nöronların iyon kanalı işlevselliği genetik ve farmasötik olarak manipüle edilebildiğinden (örneğin, iyon kanallarını inhibe etmek için gadolinyum kullanılarak) fiziksel uyaranlara (örneğin, sıcaklık, basınç ve kavitasyon) karşı nöronal duyarlılığın yüksek düzeyde kontrol edilmesini sağlar.10,11,12. Bu moleküler düzeydeki kontrol, FUS'un nöromodülatör etkilerinin arkasındaki mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Kültür ortamını aspire edin ve gömülü MEA ile 24 oyuklu bir nöron kültürü plakasındaki tek bir kuyucuğu doldurmak için kullanın (Şekil 2A). Taga ve ^ark.13 tarafından yayınlanan protokolü izleyerek nöronları kültürleyin ve indükleyin.
2. Parafilm arayüzünü, lastik bandı ve FUS konisini kauçuk membranı ile %70 etanol kullanarak 10 dakika sterilize edin ve daha sonra monte etmek üzere çeker ocak içine yerleştirin.
3. 300 mL deiyonize su ve 50 mL birleştirme jelinin gazını alın. Birleştirme ortamında kavitasyona neden olmasını önlemek için suyu ve jeli 160 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   NOT: HiPSC'lerin orijinal kaynağı GM01582 ve CIPS hücre hatlarındandır. Ortalama olarak, kuyu başına 5 x 10⁴ motor nöron ve 2.5 x 10⁴ astrosit yoğunluğu elde edilebilir¹⁴.

2. Çevre birimlerinin bağlantısı ve kurulumu

1. FUS konisini vidalar kullanarak dönüştürücüye sabitleyin ve koniyi havalandırmalı steril bir başlıkta esnek bir kauçuk membranla kapatın. Koniyi adım 1.3'ten itibaren gazı alınmış ve deiyonize edilmiş (DG-DI) suyla doldurun ve kavitasyonu önlemek için konide kabarcık olmadığından emin olun.
2. 3D baskılı tutucuyu bir çerçeveye sabitlemek için özelleştirilmiş bir dişli çubuk kullanın (Şekil 2B). Çerçeveyi, FUS dönüştürücünün kafası uyarılacak kuyunun üzerinde olacak şekilde konumlandırın.
3. Ortamı ve HiPSC'leri içeren 24 oyuklu MEA plakasındaki kuyu üzerinde parafilmi sabitlemek için bir lastik bant kullanın.
4. Ultrason dönüştürücüsünün arka uç sürücü elektroniğini, bu durumda dönüştürücü güç çıkışını (TPO; Şekil 3A), 100-240 V'luk bir elektrik prizine (Şekil 3B, Bağlantı 6) ve eşleşen ağı TPO ve FUS dönüştürücüye bağlama (sırasıyla Şekil 3B, Bağlantı 1 ve Bağlantı 2). Eşleşen ağ, dönüştürücü ve TPO arasında verimli bir elektrik bağlantısı sağlar.
5. MEA sistemini bir elektrik prizine (100-240 V) bağlayın (Şekil 3B, Bağlantı 5). MEA sistem senkronizasyon bağlantı noktasını TPO'ya bağlayın (Şekil 3B, Bağlantı 3). Bu bağlantı, MEA sistemi tarafından veri alımını FUS stimülasyonu ile senkronize edecektir.
6. 24 oyuklu MEA plakasını MEA sistemine yerleştirin ve dönüştürücü ile kuyu arasında doğrudan temas sağlamak için kapağı çıkarın. Adım 5'de açıklandığı gibi, gazdan arındırılmış kuplaj jeline yer açmak için dönüştürücüyü kuyu plakasının 10-3.2 mm yukarısına yerleştirin (Şekil 3A ve Şekil 2B).

3. Stimülasyon ve nöronal sinyal alımı

1. TPO kontrol panelinde FUS parametrelerini ayarlayın (Tablo 1).
2. Birleştirme jelini parafilmin üzerine uygulayın ve FUS dönüştürücüyü bağlantı jeline indirin, jel ile minimum hava kabarcığı ile temas sağlayın (Şekil 2A).
3. Kullanıcı arayüzündeki Başlat düğmesine tıklayarak MEA sistem kaydını başlatın.
4. TPO'daki sağ alt düğmeye basarak FUS sonikasyonunu başlatın (Şekil 3A, Etiket 7) ve nöronların temel duruma dönmesine izin vermek için her sonikasyon turu arasında en az 5 dakika bekleyin.
5. FUS stimülasyon dizisini MEA kaydına hizalamak için FUS sistemi tarafından üretilen tetikleme darbesini kullanın (Şekil 3B, Bağlantı 3).

4. Veri işleme ve analiz

1. Bir USB bağlantısı kullanarak verileri MEA sisteminden bilgisayara aktarın (Şekil 3B, Bağlantı 4). Deneme Kurulumu panelini tıklayarak bu işlemi başlatın. Ardından, kaydetmek istediğiniz veri türünü seçin. Bu durumda, ham sivri uçlar önerilir. Son olarak, dosyayı adlandırın ve aktarımı tamamlamak için disk sürücüsünde istediğiniz konumu seçin.
   NOT: Aşağıdaki adımlar, https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod'de yayınlanan Python betiği çalıştırılarak gerçekleştirilebilir.
2. 16 elektrotun her birinden gelen verileri okuyun.
3. Butterworth sırası 8 ile 5 Hz ila 3 kHz bant genişliğine sahip bir Butterworth bant geçiren filtre uygulayın.
   NOT: Bu değerleri optimize etmek için, belirli hücrelerin ateşleme hızını ve ilgili hücre sayısını hesaba katmak çok önemlidir. Bu 2 değeri çarparak, deneydeki hücre popülasyonunun genel ateşleme hızı tahmin edilebilir.
4. Sinyali yumuşatmak için σ = 3 olan bir Gauss filtresi uygulayın.
   NOT: Aşırı yumuşatma, alımdan sonra veri bozulmasına neden olabileceğinden ve çok az yumuşatma istenmeyen gürültüye neden olacağından, parametre MEA sisteminden önerilen değerlere göre optimize edilebilir.
5. Potansiyel ani artışları tespit etmek için Gauss ile yumuşatılmış sinyalin standart sapmasının 5 katı olarak bir eşik ayarlayın.
6. 16 kanalın tamamında 50 ms'lik bir pencerede kaydedilen ani yükselme sayısını pencerenin uzunluğuna (yani 50 ms) bölerek ateşleme hızını hesaplayın. Sinyal boyunca pencereyi bir sonraki kareye kaydırın ve ateşleme hızı hesaplamasını tekrarlayın (Ek Şekil 1).
7. FUS ile ilişkili ateşleme hızındaki değişikliğe bağlı olarak aktarılan verilerden FUS sonikasyon süresini okuyarak sinyali analiz edin.

5. Çok kuyulu MEA plaka temizleme ve yeniden kullanım

1. Deneyler tamamlandıktan sonra, elektrot yüzeyinden kaçınmaya dikkat ederek, ortamı çok kuyulu plakadaki oyuklardan dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
2. Kuyu başına 2 mL DG-DI su ekleyin. Aspire edin ve bir kez tekrarlayın.
3. Herhangi bir hücreyi ve döküntüyü çıkarmak için, plakaya 10 mL steril DG-DI su (oyuk başına 0.3 mL) ile 1 g enzimatik deterjan Terg-A-Zyme karışımı ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe etmeye bırakın.
4. Ertesi gün, çözeltiyi kuyulardan çıkarın ve 1 mL steril DG-DI su ile durulayın.
5. Çok kuyulu plakayı 5-7 dakika inkübe edin ve aspire edin. Bu adımı 5 kez tekrarlayın.
6. Kuyucuk başına 0,5 mL steril DG-DI su ekleyin. MEA plakasının temiz olduğunu doğrulamak için temizlenmiş çok kuyulu plakanın taban çizgisini kaydedin. Temizlenmiş bir plaka, düşük yoğunluk değerlerine sahip Gauss gürültü desenleri sergilemelidir.
7. Temizlenmiş çok kuyulu plakayı tekrar kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. MEA'ların depolandığı suyu ayda en az bir kez değiştirin.

Özetle, HiPSC'lerden kültürlenen nöronları kullanarak in vitro FUS nöromodülasyon monitörizasyonunu sağlayan bir protokol sunuyoruz. HiPSC ile indüklenen nöronları uyarmak ve analiz için karşılık gelen elektriksel tepkileri kaydetmek için genel sistem platformu Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu çalışma, Şekil 2'de gösterildiği gibi, nöronların FUS stimülasyonuna ve bir MEA sistemindeki elektriksel tepkilerin kaydedilmesine odaklanmaktadır. FUS ve MEA sistemlerinin çevresel bileşenleri ve bağlantıları Şekil 3'te gösterilmektedir.

Odak noktasının karakterizasyonu, kuyu tabanının FUS odak noktası tarafından tamamen kaplandığından emin olmak için nöronal deneylerden önce gerçekleştirilir. FUS sistemini değerlendirmek için Şekil 4'te gösterildiği gibi termokromik levhalar üzerindeki odak noktasının görselleştirilmesi yapılmalıdır. Odak noktası karakterizasyonunu takiben, filtreleme, eşikleme ve ateşleme hızının hesaplanması dahil olmak üzere işlem sonrası adımlar gerçekleştirilmelidir ve bunlar Şekil 5 ve Şekil 6'da özetlenmiştir. Bu adımlar, çevreden gelen gürültüyü filtreleyerek yararlı sinyaller almak ve böylece FUS'un neden olduğu nöronal aktivite değişiklikleri hakkında fikir edinmek için gereklidir. Şekil 6A-B'deki Raster grafikleri, her kanalda tespit edilen ani artışları göstermektedir. Kuyu tabanının tamamı FUS dönüştürücünün odak noktası içinde olduğundan, FUS'un tüm elektrotlardaki ateşleme hızını değiştirmesi beklenir. Ateşleme hızındaki bu değişiklik, Şekil 6C'de gösterilen ateşleme hızı grafiğinde görselleştirilir ve bu, seçilen stimülasyon parametrelerinin nöronal ateşleme hızında bir artışa neden olduğunu gösterir. Spesifik olarak, FUS öncesi (yani taban çizgisi) ateşleme hızı 140 Hz ± 116.7 Hz iken, FUS sonrası ateşleme hızı sürekli dalga FUS ile 786 Hz ± 419.4 Hz idi. Ek olarak, Şekil 6C, FUS parametrelerinin değiştirilmesinin (örneğin, sürekli dalga yerine darbeli dalga FUS kullanılması) ateşleme hızındaki değişimin büyüklüğünü nasıl değiştirebileceğini ve nöronların başlangıç durumlarına dönmeden önceki süreyi nasıl değiştirebileceğini göstermektedir. Düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason (LIFU), özellikle termal lezyon elde etmeyi amaçlayan yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason ile karşılaştırıldığında, kültürlerin önemli ölçüde ısınmasına neden olmaz. Klinik olarak etkili sıcaklık değişiminin olmaması, teorik hesaplamalar ve simülasyonlarla desteklenmektedir (Ek Şekil 2). Tablo 1'de listelenen deneysel FUS parametrelerinin aşırı durumlarında bile, sıcaklıkta yaklaşık 0.04 °C'lik minimum bir artış gözlemlenebilir.

Bir ateşleme hızı grafiğinin kullanılması, FUS'un nöromodülatör etkilerinin ölçülmesini sağlar ve uyarıcı ve inhibitör yanıtlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Çok kuyulu MEA plakasının önemli bir avantajı, değişen nöronal durumları ve stimülasyon parametrelerini yüksek verimli bir şekilde incelemek için birden çok kez yeniden kullanılabilmesidir.

Şekil 1: Bir kuyucuktaki nöronların odaklanmış ultrason (FUS) nöromodülasyonu ve bir mikroelektrot dizisi kullanılarak nöronal aktivitelerinin ölçümü için in vitro platforma genel bakış. Her elektrot (kırmızı, yeşil ve mavi çizgiler) tek bir kuyucuk içindeki bir nöron popülasyonundan kayıt yapar. Ham nöronal elektriksel kayıtları, nöronal ateşleme modellerinin tespitine dönüştürmek için bir işleme hattı uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çok kuyulu mikroelektrot dizisi (MEA) ile FUS nöromodülasyonu. (A) Çok kuyulu MEA ile FUS nöromodülasyonu için kurulumun şeması. FUS dönüştürücü tarafından üretilen akustik dalgalar, gazı alınmış su ile doldurulmuş bir FUS konisi boyunca yayılır ve ultrason jeli kullanılarak birleştirilir. Parafilm, kontaminasyonu önlemek için bir lastik bant kullanılarak kuyuya sabitlenir. MEA plakası, nöronlardan MEA sistemine elektriksel kayıtlar gönderir. (B) MEA sisteminde bulunan çok kuyulu plaka üzerindeki FUS dönüştürücüsünün bir fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: In vitro platform kurulumu. (A) In vitro platform kurulumunun ön tarafı. Dönüştürücü güç çıkışı (TPO; solda) FUS parametrelerini programlamak için kullanılır. MEA sistemi (sağda), FUS dönüştürücü tarafından nöromodüle edilen kuyu plakasındaki nöronlardan gelen elektriksel aktiviteyi kaydeder. (B) Eşleşen ağdan (1) TPO'ya ve (2) dönüştürücüye bağlantılar ile in vitro platform kurulumunun arkası. (3) MEA sisteminden TPO'ya bağlantı, veri alımını senkronize eder. (4) Veri aktarımı için MEA sisteminden bilgisayara bağlantı. (5) MEA sistemine güç bağlantısı. (6) FUS sistemine güç bağlantısı. (7) Sonikasyon düğmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: FUS dönüştürücünün karakterizasyonu. (A) AMPLITUDE sistemi¹⁵ tarafından ölçülen Tablo 1'de ayrıntıları verilen FUS parametrelerini kullanarak odak noktasının basınç haritası. (B) Şekil 3'te gösterilen deney düzeneğini kullanarak bir kuyunun dibine yerleştirilen bir termokromik tabakanın sonikasyon öncesi ve sonrası. Termokromik tabaka, sıcaklık değişikliklerine yanıt olarak renk değiştirir, bu da nöronların bulunduğu yerde başarılı bir stimülasyonun görsel olarak doğrulanmasını sağlar. 30 W /^cm2'lik maksimum uzamsal tepe darbe ortalama yoğunluğu (I_SPPA) ve 3 dakikalık sürekli sonikasyon, böyle bir odak noktasının daha iyi görselleştirilmesi için yerel sıcaklığı büyük ölçüde değiştirecek şekilde ayarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İşlem hattı. Adım 1: Ham elektrik kayıtları N = 16 kanaldan yakalanır. Gelecekteki adımlar, kanal 16'yı (kırmızı ile özetlenmiştir) kullanarak işlemi gösterir. Adım 2: Her kanal için bir Butterworth bant geçiren filtre (5 Hz ila 3 kHz bant geçirgen) ve ardından bir Gauss filtresi (σ = 3) uygulanır. Bir eşik, sonikasyonun başlangıcında ortalanmış 2 saniyelik bir pencere içinde sinyalin standart sapmasının beş katı olarak ayarlanır. Adım 3: Eşiğin üstündeki veya altındaki sinyaller ani artışlar olarak nitelendirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Raster ve ateşleme hızı grafikleri. (A) Sonikasyon süresinin bir fonksiyonu olarak her kanalda tespit edilen sivri uçların raster grafiği. FUS stimülasyonunun zamanı kırmızı bir çizgi kullanılarak açıklanır. (B) Karşılaştırma için sürekli FUS ile farklı FUS ayarları altında nöronların raster grafiği. (C) Ateşleme hızı, 50 ms'lik bir sürgülü pencere kullanılarak hesaplanmıştır. FUS nöromodülasyonları öncesi ve sonrası ortalama ateşleme hızları sırasıyla 140 Hz ve 786 Hz idi. Darbeli FUS ile ortalama ateşleme hızları 230 Hz ve 540 Hz idi. Bu değişken FUS stimülasyonu seti tarafından daha kısa bir aktivasyon ve daha az hız değişikliğinin indüklendiği gözlendi. Ateşleme hızını hesaplama işlemi Ek Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Şekil 4'te sunulan çalışma için TPO'da ayarlanan odaklanmış ultrason (FUS) parametreleri.

Ek Şekil 1: Raster grafiğinden ateşleme hızına kadar işleme. Adım 1: Belirli bir kayan penceredeki sayım sayısını elde etmek için tüm kanallar arasındaki sivri uçları sayın. Not: Burada, daha iyi gösterim için daha büyük bir sürgülü pencere (0,1 s'ye ayarlanmış) seçilmiştir. Adım 2: Pencere uzunluğu başına ani artışları saniyedeki ani artışlara dönüştürün (örneğin, burada, hertz [Hz]'ye dönüştürmek için sayıları 10 ile çarpın ve ardından kilohertz [kHz] cinsinden değeri elde etmek için 1.000'e bölün). Adım 3: Sonuç olarak elde edilen ateşleme hızı eğrisi. Örneklenmiş verilerle birlikte açık kaynaklı bir araç seti GitHub'da (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod) mevcuttur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: K-dalgası simülasyon sonucu LIFU^16'nın sıcaklık profili. Şekil 4'te gösterilen akustik yoğunluk haritasına dayanarak, K-dalgası simülasyon sonucu, Tablo 0.04'de listelenen deneysel FUS parametrelerinin aşırı durumunu kullanarak odak bölgesinin merkez bölgesinde (yarıçap: 2 mm) maksimum 1 °C'lik bir sıcaklık artışı önermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makale, FUS nöromodülasyonu sırasında HiPSC'lerde nöronal aktiviteyi kaydetmek için kullanılabilecek yeni bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, farklı FUS transdüserlerine ve MEA sistemlerine genelleştirilebilir. Açıklanan protokolle gözlemlenen sonuçları çoğaltmak için araştırmacı, dönüştürücünün odak noktasının MEA kuyusunun taban alanından daha büyük olmasını sağlamalıdır. Ayrıca, farklı nöronal hücre hatları kullanılıyorsa, filtre parametrelerinin kuyu içindeki hücreler için beklenen frekans tepkisine ayarlanması gerekir. Temsili sonuçlar elde edilemiyorsa, yukarıda belirtilen parametrelerin değiştirilmesi düşünülmelidir (örneğin, patlama uzunluğu, yoğunluk, görev döngüsü, vb.).

Bu çalışma, FUS stimülasyonunu takiben ateşleme hızında bir artış göstermiş olsa da, herhangi bir sonuca varılmadan önce bu bulgunun tekrarlanabilirliğini göstermek için daha fazla veri toplanmalıdır. Bu protokol, tipik olarak doğrudan mikroelektrot akım sinyali kaydından kaynaklanan zayıflıklara sahip olan MEA sistemlerinin sınırlamalarını devralır. Nöronla doğrudan temas daha iyi hassasiyet sağlasa da, hücreyi değiştirebilir ve ölçüm doğruluğunu etkileyebilir. Ayrıca, kuyucukların küçük boyutu nedeniyle, sistemimiz nöromodülasyonda da rol oynayabilecek periferik dokuyu içermez¹⁷. Bu, bu kurulumdan çıkarılan sonuçların in vivo ortamlara uygulanabilirliğini sınırlayabilir. Daha karmaşık ağ yanıtlarını incelemek için, hassasiyetini artırmak için daha yüksek kanal yoğunluğuna sahip bir MEA sistemi tasarlanmalıdır¹⁸. Dönüştürücüyü tutmak ve doğru yerleştirmeyi sağlamak için bir 3D portal kullanmak da dahil olmak üzere, önerilen bu sistem için gelecekteki birkaç yön belirlenmiştir¹⁹. Bireysel nöronları sınıflandırmak için sivri bir sıralama algoritması²⁰ kullanmak da dahil olmak üzere, işlem sonrası algoritma ile ilgili ek iyileştirmeler yapılabilir. Bu süreç, FUS mekanizmaları üzerine gelecekteki çalışmalarda çok birimli nöronların tepkilerini çözmek için faydalı olacaktır. En önemlisi, altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için kimyasal, elektriksel ve optik uyaranlar gibi ek stimülasyon yöntemlerini dahil etmek esastır. Bu yöntemler, belirli iyon kanallarını¹⁵ inhibe ederek veya membran özelliklerini²¹ değiştirerek nöronal özellikleri ve davranışları değiştirebilir. Araştırmacılar, varsayımsal sinyal yolundaki ana faktörleri modüle ederek, kontrollü ortamlarda her bir faktörün katkılarını belirleyebilir ve nihayetinde oyundaki karmaşık etkileşimlere ışık tutabilir.

Elektriksel stimülasyon²² , klinik ve araştırma ortamlarında uzun bir başarılı uygulama geçmişine sahip, nöromodülasyon için en köklü tekniklerden biridir. Buna karşılık, FUS ve optogenetik²³ , son yıllarda dikkat çeken nispeten yeni yöntemlerdir. FUS'un en büyük avantajları, invaziv olmaması ve elektriksel stimülasyon ve optogenetik dahil olmak üzere diğer tekniklerle ulaşılması zor olabilecek derinliklerde nöronları uyarma yeteneğidir. Bununla birlikte, optogenetik²⁴ gibi, FUS'un da dalga yayılımının ve ilişkili nöronal yanıtların modellenmesiyle ilgili bazı sınırlamaları vardır. Dokunun heterojen akustik özelliklerinin karmaşıklığını in vivo olarak yakalamak zor olabilir, bu da basınç alanında ve sonuç olarak nöronal tepkilerde belirsizliklere yol açar. Bu özelliklerin doğru bir şekilde modellenmesindeki bu zorluk, tekniği belirli gerçek dünya uygulamaları için optimize ederken bir zorluk teşkil eder. İçsel karmaşıklıklar, kontrollü akustik yoğunluk koşulları altında yanıtların doğrudan incelenmesini sağladıkları için bu çalışmadaki gibi in vitro sistemlerin önemini vurgulamaktadır.

Sonuç olarak, bu sistem, FUS'un insan nöronları üzerindeki nöro-modülatör etkilerini incelemek için yüksek verimli, in vitro bir platform sağlar. Bu sistemle, kontrollü bir ortamda değişen seviyelerde ve tipte stimülasyona maruz kaldığında insan nöronlarından gelen elektriksel tepkiler ölçülerek FUS'un etki mekanizmaları araştırılabilir. Bu nedenle, sahada yaygın olarak kullanılan insan ve hayvan modellerine değerli bir tamamlayıcı araç sunar.