JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Сфокусированная ультразвуковая нейромодуляция нейронных культур человека in vitro в многолуночных микроэлектродных решетках

Published: May 03, 2024
doi:
10.3791/65115
, , , , , , , , ,
1Electrical and Computer Engineering,Johns Hopkins University, 2HEPIUS Innovation Laboratory,Johns Hopkins University School of Medicine, 3Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine, 4Biomedical Engineering,Johns Hopkins University School of Medicine, 5Mechanical Engineering,Johns Hopkins University, 6Anesthesiology and Critical Care Medicine,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

В данной работе мы представляем протокол использования высокопроизводительной системы, которая позволяет осуществлять мониторинг и количественную оценку нейромодулирующих эффектов сфокусированного ультразвука на нейроны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (HiPSC).

Abstract

Нейромодулирующие эффекты сфокусированного ультразвука (ФУЗ) были продемонстрированы на животных моделях, и ФУЗ успешно используется для лечения двигательных и психических расстройств у людей. Однако, несмотря на успех ФУЗ, механизм, лежащий в основе его воздействия на нейроны, остается малоизученным, что затрудняет оптимизацию лечения путем настройки параметров ФУЗ. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, мы изучили нейроны человека in vitro , используя нейроны, культивируемые из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Использование ИПСК позволяет изучать специфическое поведение нейронов человека как в физиологических, так и в патологических состояниях. В этом отчете представлен протокол использования высокопроизводительной системы, которая позволяет осуществлять мониторинг и количественную оценку нейромодулирующего воздействия ФУЗ на нейроны HiPSC. Изменяя параметры ФУС и манипулируя нейронами ИПСК с помощью фармацевтических и генетических модификаций, исследователи могут оценить нейронные реакции и выяснить нейромодулирующее воздействие ФУС на нейроны ИПСК. Это исследование может иметь значительные последствия для разработки безопасных и эффективных методов лечения ряда неврологических и психиатрических расстройств на основе ФУЗ.

Introduction

Сфокусированный ультразвук (FUS) является перспективным методом нейромодуляции, который позволяет проводить неинвазивную стимуляцию на глубине сантиметра с субмиллиметровым разрешением 1,2,3. Несмотря на эти сильные стороны, клиническое воздействие ФУЗ ограничено, отчасти из-за недостатка знаний о механизме его действия. Не имея прочной теоретической основы, исследователи и клиницисты сталкиваются с трудностями в адаптации терапии к конкретным потребностям отдельных пациентов в различных условиях. Известная теория, предложенная Yoo et al.4, предполагает, что механочувствительные ионные каналы ответственны за активацию нейронов. Тем не менее, эта теория не может объяснить активацию FUS в нейронах человеческого мозга, у которых отсутствуютэти каналы. Эта неопределенность ограничивает использование ФУЗ в клинике, так как она исключает настройку параметров ФУЗ для оптимизации результатов лечения.

В предыдущих соответствующих исследованиях использовался ряд подходов для изучения физиологических механизмов, лежащих в основе ФУЗ, и определения оптимальных параметров стимуляции. Важнейшим этапом в этом процессе является мониторинг нейронных реакций в виде обратной связи, что может быть достигнуто с помощью методов, включающих ионно-вентильный мониторинг, таких как визуализация ионов кальция4, оптическая визуализация1 и электрофизиологическая запись ex vivo (например, электромиография6 или электрофизиология кожных нервов7). Тем не менее, в большинстве этих исследований используются нечеловеческие нейроны или подходы in vivo, которые могут вносить дополнительные отклонения из-за неоптимального контроля. Напротив, использование электродов для измерения нейронных сигналов в нейронах in vitro, индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками человека (HiPSC), обеспечивает более чувствительные измерения и больший контроль над экспериментальной средой. В этой работе была разработана система in vitro с использованием микроэлектродных решеток (МЭА) для измерения электрических ответов нейронов HiPSC после стимуляции FUS, как показано на рисунке 1. Эта система позволяет исследователям отслеживать нейронные реакции при изменении параметров ультразвука (например, частоты, длины всплеска, интенсивности). Кроме того, эта система обеспечивает высокий уровень контроля чувствительности нейронов к физическим раздражителям (например, температуре, давлению и кавитации)8,9, поскольку функциональностью ионных каналов нейронов можно манипулировать генетически и фармацевтически (например, используя гадолиний для ингибирования ионных каналов)10,11,12. Этот контроль на молекулярном уровне может помочь пролить свет на механизмы, лежащие в основе нейромодулирующих эффектов ФУЗИ.

Protocol

1. Подготовка материалов Аспирируйте питательную среду и используйте ее для заполнения одной лунки в 24-луночном планшете для культивирования нейронов со встроенным МЭА (рис. 2A). Культивирование и индуцирование нейронов в соответствии с протоколом, опубликованным Taga et al.13. Простерилизуйте интерфейс парапленки, резиновую ленту и конус FUS с резиновой мембраной с использованием 70% этанола в течение 10 минут и поместите их в вытяжной шкаф для последующей сборки. Дега 300 мл деионизированной воды и 50 мл соединительного геля. Центрифугируйте воду и гель при концентрации 160 x g в течение 5 мин, чтобы избежать кавитации в соединительной среде.ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальным источником ИПСК являются клеточные линии GM01582 и CIPS. В среднем плотность 5 х 104 двигательных нейронов и 2,5 х 104 астроцитов на лунку может быть достигнута14. 2. Подключение и настройка периферийных устройств Закрепите конус FUS на датчике с помощью винтов и загерметизируйте конус гибкой резиновой мембраной в вентилируемом стерильном колпаке. Наполните конус дегазированной и деионизированной (DG-DI) водой из шага 1.3 и убедитесь в отсутствии пузырьков в конусе, чтобы избежать кавитации. Используйте специальный резьбовой стержень, чтобы прикрепить напечатанный на 3D-принтере держатель к раме (рис. 2B). Расположите раму таким образом, чтобы головка преобразователя FUS находилась над скважиной, которая будет стимулироваться. Используйте резиновую ленту, чтобы закрепить парапленку над лункой на 24-луночной пластине MEA, содержащей среду и HiPSCs. Подготовьте систему FUS, подключив электронику драйвера ультразвукового датчика, в данном случае выходную мощность преобразователя (TPO; Рисунок 3A), к розетке 100-240 В (Рисунок 3B, Подключение 6) и подключение согласующей сети к TPO и преобразователю FUS (Рисунок 3B, Подключение 1 и Соединение 2 соответственно). Согласующая цепь обеспечивает эффективную электрическую связь между преобразователем и ТПО. Подключите систему MEA к розетке (100–240 В) (Рисунок 3B, Подключение 5). Подключите порт синхронизации системы MEA к TPO (Рисунок 3B, Подключение 3). Это соединение позволит синхронизировать сбор данных системой МЭА с ФУЗИ-стимуляцией. Поместите 24-луночную пластину МЭА в систему МЭА и снимите крышку, чтобы обеспечить прямой контакт между датчиком и лункой. Поместите преобразователь на 5-10 мм выше луночной пластины, чтобы освободить место для дегазированного соединительного геля, как описано в шаге 3.2 (Рисунок 3A и Рисунок 2B). 3. Стимуляция и получение сигналов от нейронов Задайте параметры FUS на панели управления TPO (Таблица 1). Нанесите соединительный гель поверх парапленки и опустите датчик FUS в соединительный гель, обеспечив контакт с гелем с минимальным количеством пузырьков воздуха (Рисунок 2A). Запустите системную запись MEA, нажав кнопку «Пуск » в пользовательском интерфейсе. Начните ультразвуковую терапию FUS, нажав нижнюю правую кнопку на TPO (рис. 3A, метка 7), и подождите не менее 5 минут между каждым раундом ультразвуковой обработки, чтобы нейроны вернулись в исходное состояние. Используйте триггерный импульс, генерируемый системой FUS, для выравнивания последовательности стимуляции FUS с записью MEA (Рисунок 3B, Соединение 3). 4. Обработка и анализ данных Перенесите данные из системы MEA на компьютер с помощью USB-соединения (рис. 3B, подключение 4). Для начала нажмите на панель «Настройка эксперимента ». Затем выберите тип данных, которые вы хотите записать. В этом случае рекомендуются сырые шипы. Наконец, присвойте файлу имя и выберите нужное место на диске, чтобы завершить передачу.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги можно выполнить, запустив выпущенный скрипт Python в https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. Считывание данных с каждого из 16 электродов. Примените полосовой фильтр Баттерворта с полосой пропускания от 5 Гц до 3 кГц с порядком Баттерворта 8.ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации этих значений крайне важно учитывать частоту срабатывания конкретных ячеек и количество задействованных ячеек. Перемножив эти 2 величины, можно оценить общую частоту возбуждения клеточной популяции в эксперименте. Примените фильтр Гаусса с σ = 3 для сглаживания сигнала.ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр может быть оптимизирован на основе рекомендуемых значений системы MEA, так как чрезмерное сглаживание может привести к искажению данных после сбора, а слишком слабое сглаживание приведет к появлению нежелательного шума. Установите пороговое значение для обнаружения всплесков потенциала, в 5 раз превышающее стандартное отклонение сглаженного по Гауссу сигнала. Вычислите частоту срабатывания, разделив количество пиков, зарегистрированных в окне 50 мс по всем 16 каналам, на длину окна (т. е. 50 мс). Сдвиньте окно по сигналу на следующий кадр и повторите расчет скорострельности (дополнительный рисунок 1). Анализ сигнала путем считывания времени ультразвуковой обработки ФУС из переданных данных данных на основе изменения скорости срабатывания, связанного с ФУ. 5. Очистка и повторное использование многолуночных пластин MEA После завершения экспериментов с помощью пипетки осторожно удалите среду из лунок в многолуночном планшете, стараясь избегать поверхности электрода. Добавьте 2 мл воды DG-DI на лунку. Сделайте аспирацию и повторите один раз. Чтобы удалить клетки и мусор, добавьте в тарелку смесь из 1 г ферментативного моющего средства Terg-A-Zyme с 10 мл стерильной воды DG-DI (0,3 мл на лунку). Оставьте его инкубироваться на ночь при комнатной температуре (RT). На следующий день извлеките раствор из лунок и промойте их 1 мл стерильной воды DG-DI. Инкубируйте мультилуночную чашку в течение 5-7 мин и аспирируйте. Повторите этот шаг 5 раз. Добавьте 0,5 мл стерильной воды DG-DI на лунку. Запишите базовую линию очищенной многолуночной планшета, чтобы убедиться в чистоте планшета MEA. Очищенная пластина должна демонстрировать гауссовы шумовые картины с низкими значениями интенсивности. Храните очищенную многолуночную пластину при температуре 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к повторному использованию. Меняйте воду, в которой хранятся МЭА, не реже одного раза в месяц.

Representative Results

Таким образом, мы представляем протокол, который позволяет проводить мониторинг нейромодуляции FUS in vitro с использованием нейронов, культивируемых из ИПСК. Общая системная платформа для стимуляции HiPSC-индуцированных нейронов и записи соответствующих электрических реакций для анализа показана на рисунке 1. Это исследование сосредоточено на стимуляции нейронов FUS и регистрации электрических ответов в системе MEA, как показано на рисунке 2. Периферийные компоненты систем FUS и MEA и их соединения проиллюстрированы на рисунке 3. Определение характеристик фокальной точки проводится до проведения нейронных экспериментов, чтобы убедиться, что дно лунки полностью покрыто фокальной точкой FUS. Визуализация фокального пятна на термохромных листах, как показано на рисунке 4, должна быть выполнена для оценки системы FUS. После определения характеристик фокального пятна необходимо выполнить этапы постобработки, включая фильтрацию, определение пороговых значений и расчет частоты срабатывания, которые обобщены на рисунках 5 и 6. Эти шаги необходимы для извлечения полезных сигналов путем фильтрации шума из окружающей среды и, таким образом, для получения информации об изменениях активности нейронов, вызванных FUS. Растровые графики на рисунке 6A-B показывают обнаруженные пики в каждом канале. Поскольку все дно лунки находится в фокусной точке преобразователя FUS, ожидается, что FUS должен изменять скорость срабатывания на всех электродах. Это изменение частоты возбуждения визуализируется на графике частоты возбуждения, показанном на рисунке 6C, который показывает, что выбранные параметры стимуляции привели к увеличению частоты возбуждения нейронов. В частности, частота срабатывания до FUS (т.е. базовая) составляла 140 Гц ± 116,7 Гц, в то время как частота срабатывания после FUS составляла 786 Гц ± 419,4 Гц с непрерывной частотой срабатывания. Кроме того, на рисунке 6C показано, как изменение параметров FUS (например, использование импульсно-волнового FUS вместо непрерывного) может изменить величину изменения скорости возбуждения, а также изменить количество времени, прежде чем нейроны вернутся в исходное состояние. Низкоинтенсивный фокусированный ультразвук (LIFU) не вызывает значительного нагрева культур, особенно по сравнению с высокоинтенсивным фокусированным ультразвуком, который направлен на достижение термического поражения. Отсутствие клинически значимого изменения температуры подтверждается теоретическими расчетами и моделированием (дополнительный рисунок 2). Даже в крайних случаях экспериментальных параметров ФУ, перечисленных в таблице 1, можно было наблюдать лишь минимальное повышение температуры примерно на 0,04 °C. Использование графика скорости возбуждения позволяет количественно оценить нейромодулирующие эффекты ФУЗ и может быть использовано для дифференциации возбуждающих и тормозных реакций. Существенным преимуществом многолуночного планшета MEA является то, что его можно многократно использовать для изучения различных состояний нейронов и параметров стимуляции с высокой пропускной способностью. Рисунок 1: Обзор платформы in vitro для нейромодуляции нейронов в лунке с помощью сфокусированного ультразвука (FUS) и измерения их нейрональной активности с помощью микроэлектродной матрицы. Каждый электрод (красная, зеленая и синяя линии) записывает данные из популяции нейронов в пределах одной лунки. Реализован конвейер обработки для преобразования необработанных нейронных электрических записей в обнаружение паттернов возбуждения нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Нейромодуляция FUS с помощью многолуночной микроэлектродной матрицы (MEA). (A) Схема установки нейромодуляции FUS с помощью многолуночного МЭА. Акустические волны, генерируемые ФУЗ-преобразователем, распространяются через конус ФУС, заполненный дегазированной водой, и соединяются с помощью ультразвукового геля. Парапленка крепится к колодцу с помощью резиновой ленты для предотвращения загрязнения. Пластина MEA посылает электрические записи от нейронов в систему MEA. (B) Фотография преобразователя FUS на многолуночном планшете, содержащемся в системе MEA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Настройка платформы in vitro . (A) Передняя часть платформы in vitro . Выходная мощность преобразователя (TPO; слева) используется для программирования параметров FUS. Система МЭА (справа) регистрирует электрическую активность нейронов в луночной пластине, которые нейромодулируются датчиком ФУЗ. (B) Задняя часть платформы in vitro с соединениями от согласующей сети (1) к TPO и (2) к преобразователю. (3) Соединение между системой MEA и TPO синхронизирует сбор данных. (4) Подключение системы MEA к компьютеру для передачи данных. (5) Подключение питания к системе MEA. (6) Подключение питания к системе FUS. (7) Кнопка ультразвуковой обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Определение характеристик преобразователя FUS. (A) Карта давления фокального пятна с использованием параметров FUS, подробно описанных в таблице 1 , измеренных с помощью системы AMPLITUDE15. (B) Предварительное и последующее ультразвуковое воздействие термохромного листа, размещенного на дне скважины, с использованием экспериментальной установки, показанной на рисунке 3. Термохромный лист меняет цвет в ответ на изменения температуры, что обеспечивает визуальную проверку успешной стимуляции в месте расположения нейронов. Максимальная пространственно-пиковая средняя интенсивность импульса (ISPPA) 30 Вт/см2 и непрерывное ультразвуковое воздействие в течение 3 мин были скорректированы для резкого изменения локальной температуры для лучшей визуализации такой фокальной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Конвейер обработки. Шаг 1: Необработанные электрические записи захватываются с N = 16 каналов. Дальнейшие шаги показывают процесс с использованием канала 16 (обведен красным цветом). Шаг 2: Для каждого канала применяется полосовой фильтр Баттерворта (полоса пропускания от 5 Гц до 3 кГц), за которым следует фильтр Гаусса (σ = 3). Пороговое значение устанавливается равным пятикратному стандартному отклонению сигнала в течение окна в 2 с, центрированного в начале ультразвуковой обработки. Шаг 3: Сигналы выше или ниже порога характеризуются как пики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Растровые графики и графики скорости стрельбы. (A) Растровый график обнаруженных всплесков в каждом канале в зависимости от времени ультразвуковой обработки. Время стимуляции ФУЗ обозначается красной линией. (B) Растровый график нейронов при различных настройках FUS с непрерывным FUS для сравнения. (C) Скорострельность рассчитывалась с использованием скользящего окна 50 мс. Средняя частота срабатывания до и после нейромодуляции FUS составила 140 Гц и 786 Гц соответственно. При использовании импульсного ФУС средняя частота стрельбы составляла 230 Гц и 540 Гц. Наблюдалось, что более короткая активация и меньшее изменение скорости индуцируются этим набором различных ФУЗ-стимуляций. Процесс расчета скорострельности подробно описан на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Параметр Ценность Максимальная мощность/канал 1.200 Вт Pфакт 0,749 Вт/канал. ISPPA 10,79 Вт/см2 IЗИП 0,05 Вт/см2 Длина пакета 0,100 мс Частота 250,00 кГц Фокус 39.800 мм Период 20.000 мс Таймер 60.000 сек Таблица 1: Параметры фокусированного ультразвука (ФУЗ), установленные на ТПО для исследования, представлены на рисунке 4. Дополнительный рисунок 1: Обработка от растрового графика до скорости стрельбы. Шаг 1: Подсчитайте пики между всеми каналами, чтобы получить номер счетчика в заданном скользящем окне. Примечание: Здесь для лучшей иллюстрации было выбрано большее скользящее окно (установленное на 0,1 с). Шаг 2: Преобразуйте пики на длину окна в пики в секунду (например, здесь умножьте счетчики на 10, чтобы преобразовать их в герц [Гц], а затем разделите на 1,000, чтобы получить значение в килогерцах [кГц]). Шаг 3: Кривая скорострельности, полученная в результате. Набор инструментов с открытым исходным кодом вместе с выборкой данных доступен на GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительный рисунок 2: Температурный профиль результата моделирования K-волны LIFU16. Основываясь на карте акустической интенсивности, показанной на рисунке 4, результаты моделирования K-волн позволяют предположить максимальное повышение температуры на 0,04 °C в центральной области фокальной зоны (радиус: 2 мм) с использованием крайнего случая экспериментальных параметров FUS, перечисленных в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

В данной статье описывается новый метод, который может быть использован для регистрации нейрональной активности в ИПСК во время нейромодуляции FUS. Этот протокол может быть обобщен для различных преобразователей ФУС и систем MEA. Чтобы воспроизвести результаты, наблюдаемые с помощью описанного протокола, исследователь должен убедиться, что фокальная точка преобразователя больше, чем площадь дна скважины МЭА. Кроме того, если используются различные линии нейрональных клеток, параметры фильтра должны быть настроены в соответствии с ожидаемой частотной характеристикой для клеток внутри лунки. Если репрезентативные результаты не могут быть достигнуты, следует рассмотреть возможность изменения вышеупомянутых параметров (например, длины пакета, интенсивности, скважности и т. д.).

Несмотря на то, что эта работа продемонстрировала увеличение частоты срабатывания после стимуляции FUS, необходимо собрать больше данных, чтобы продемонстрировать повторяемость этого вывода, прежде чем делать какие-либо выводы. Этот протокол унаследовал ограничения MEA-систем, которые, как правило, имеют недостатки, связанные с прямой записью сигнала тока микроэлектродами. Хотя прямой контакт с нейроном обеспечивает лучшую чувствительность, он может изменить клетку и повлиять на точность измерения. Кроме того, из-за небольшого размера лунок наша система не включает периферические ткани, которые также могут играть роль в нейромодуляции17. Это может ограничить применимость выводов, сделанных на основе этой установки, к среде in vivo . Для изучения более сложных сетевых откликов необходимо спроектировать систему МЭА с более высокой плотностью каналов, чтобы повысить ее чувствительность18. Было определено несколько будущих направлений для этой предлагаемой системы, в том числе использование 3D-портала для удержания преобразователя и обеспечения точного размещения19. Дополнительные улучшения могут быть сделаны в отношении алгоритма постобработки, включая использование алгоритма сортировки пиков20 для классификации отдельных нейронов. Этот процесс был бы полезен для распутывания ответов многозвенных нейронов в будущих исследованиях механизмов FUS. Самое главное, важно включить дополнительные методы стимуляции, такие как химические, электрические и оптические стимулы, чтобы прояснить лежащие в их основе механизмы. Эти методы могут изменять свойства и поведение нейронов, например, путем ингибирования специфических ионных каналов15 или изменения характеристик мембраны21. Модулируя основные факторы в гипотетическом сигнальном пути, исследователи могут определить вклад каждого фактора в контролируемой среде и, в конечном итоге, пролить свет на сложные взаимодействия.

Электростимуляция22 является одним из наиболее известных методов нейромодуляции с долгой историей успешного применения в клинических и исследовательских условиях. Напротив, ФУЗ и оптогенетика23 являются относительно новыми методами, которые привлекли внимание в последние годы. Основными преимуществами ФУЗИ являются его неинвазивность и способность стимулировать нейроны на глубине, которую может быть трудно достичь с помощью других методов, включая электростимуляцию и оптогенетику. Однако, как и оптогенетика24, FUS имеет некоторые ограничения, связанные с моделированием распространения волн и связанных с ними нейронных реакций. Учет сложности гетерогенных акустических свойств тканей in vivo может быть сложной задачей, что приводит к неопределенности в поле давления и, следовательно, в нейронных реакциях. Эта сложность в точном моделировании этих свойств представляет собой проблему при оптимизации метода для конкретных реальных приложений. Присущие им сложности подчеркивают важность систем in vitro , подобных той, что была показана в этом исследовании, поскольку они позволяют непосредственно изучать реакцию в условиях контролируемой акустической интенсивности.

В заключение, эта система обеспечивает высокопроизводительную платформу in vitro для изучения нейромодулирующих эффектов FUS на нейроны человека. С помощью этой системы механизмы действия FUS могут быть изучены путем измерения электрических реакций нейронов человека при воздействии различных уровней и типов стимуляции в контролируемой среде. Таким образом, он предлагает ценный дополнительный инструмент к моделям человека и животных, обычно используемым в полевых условиях.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Амир Манбачи и Нитиш Тхакор выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA), контракт на заключение контракта: N660012024075. Кроме того, Амир Манбачи выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Программы клинических и трансляционных исследований (KL2) Института клинических и трансляционных исследований Университета Джонса Хопкинса (ICTR), администрируемой Национальным центром развития трансляционных наук (NCATS) и Национальными институтами здравоохранения (NIH). Нитиш Тхакор выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH): R01 HL139158-01A1 и R01 HL071568-15.

Materials

MEA System Axion Biosystem Inc. Maestro Edge Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate Axion Biosystem Inc. CytoView MEA Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface Amcor Inc. Parafilm PM996; P7793 Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture AirGas Inc./ Harris Inc. 9296NC Concentration: 5%
Culture Media ThermoFisher Inc. Laminin; 23017-015 Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons Peprotech CIPS and GM01582 Derived; 450-10 Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer Sonic Concepts Inc. CTX250; 008 Center Frequency: 250 kHz
Matching Network Sonic Concepts Inc. CTX250; NFS102v2 Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO) Sonic Concepts Inc. Version 4.1; 020 Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane McMaster Inc. Silicone Rubber; 5542N115 Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel Parker Laboratory Inc. Aquasonic 100; B08DDWG GXB Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder McMaster Inc. Steal Threaded Rod; 90322A661 Length: 1–1/2" Long
Centrifuge ThermoFisher Inc. Sorvall Legend X1R; 75004261 Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone Sonic Concepts Inc. Y-104; 009 Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank Sonic Concepts Inc. WT Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit Sonic Concepts Inc. WCU; SN006 Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope Rohde-Schwarz Inc. RTC1002 Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage Sonic Concepts Inc. MicroStage; 2 Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet TIPTEMP Inc. Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 Range: 22–24 °C
Computer Microsoft Surface Surface Pro CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software Mathworks Inc. MATLAB Version 2021b
Processing Software Python Software Foundation Python Version 3.7.10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment. Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).
  2. Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. . The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , (2022).
  3. . Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner’s Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021)
  4. Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification. Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).
  5. Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. The form and function of PIEZO2. Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).
  6. Kim, H., et al. Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).
  7. Hoffman, B. U., et al. Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119 (2022).
  8. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
  9. Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron. eNeuro. 8 (2), (2021).
  10. Chalfie, M. Neurosensory mechanotransduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (1), 44-52 (2009).
  11. Launay, P., et al. TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization. Cell. 109 (3), 397-407 (2002).
  12. Cain, S. M., Snutch, T. P. Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing. Channels. 4 (6), 475-482 (2010).
  13. Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726 (2021).
  14. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  15. Manuel, T. J., et al. Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX. Scientific Reports. 10 (1), 15347 (2020).
  16. Treeby, B. E., Cox, B. T. k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields. J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314 (2010).
  17. Akhtar, K., et al. Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease. Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).
  18. Smirnova, L., et al. Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish. Frontiers in Science. 1, 1017235 (2023).
  19. Saccher, M., et al. Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA. Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2 (2022).
  20. Yger, P., et al. A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo. eLife. 7, e34518 (2018).
  21. Babakhanian, M., et al. Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins. Scientific Reports. 8, 17250 (2018).
  22. Liang, R., et al. Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude). 2022 Design of Medical Devices Conference. , (2022).
  23. Ko, H., Yoon, S. -. P. Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review. Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).
  24. White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design. Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).

Tags

Focused UltrasoundNeuromodulationNeural CulturesMicroelectrode ArraysHIPSCsNeuronal ActivityFiring RateFUS ParametersIn Vitro Testing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Liang, R., Mess, G., Punnoose, J., Kempski Leadingham, K. M., Smit, C., Thakor, N., Habela, C. W., Tyler, B., Salimpour, Y., Manbachi, A. Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (207), e65115, doi:10.3791/65115 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image