Preparazione di matrici decellularizzate 3D da muscolo scheletrico fetale di topo per coltura cellulare

La matrice extracellulare (ECM) è un costituente importante dei tessuti, che rappresenta la loro componente non cellulare. Questa struttura tridimensionale (3D) non solo fornisce supporto fisico per le cellule, ma svolge anche un ruolo cruciale nei processi biochimici coinvolti nello sviluppo degli organismi¹. La formazione di una ECM tessuto-specifica avviene durante lo sviluppo, come risultato delle complesse interazioni tra le cellule e le loro nicchie, influenzate da vari stimoli intra ed extracellulari. L’ECM è una struttura altamente dinamica che subisce riarrangiamenti chimici e meccanici in modo temporale-spaziale e influisce direttamente sul destino cellulare². Una delle caratteristiche più notevoli della MEC è la sua diversità funzionale, poiché ogni ECM tissutale mostra una combinazione unica di molecole che forniscono diverse topologie e proprietà adattate alle cellule che contiene¹.

La segnalazione e il supporto della ECM sono cruciali per lo sviluppo e l’omeostasi e, se interrotti, possono portare a molteplici condizioni patologiche ^3,4. Un esempio è la distrofia congenita con deficit di LAMA2 (LAMA2-CMD), che è la forma più comune di distrofia muscolare congenita. Il gene LAMA2 codifica per la catena α2 della laminina, che è presente nella laminina 211 e nella laminina 221, e quando mutato può portare a LAMA2-CMD ⁵. La laminina 211 è l’isoforma principale presente nella membrana basale che circonda le fibre muscolari scheletriche. Quando la laminina 211 è anormale o assente, il legame tra la membrana basale e le cellule muscolari viene interrotto, portando all’insorgenza della malattia⁶. I pazienti con LAMA2-CMD mostrano un fenotipo da lieve a grave a seconda del tipo di mutazione nel gene LAMA2.

Quando la funzione della proteina α2 della laminina è compromessa, i pazienti possono sperimentare una grave ipotonia muscolare alla nascita e sviluppare infiammazione cronica, fibrosi e atrofia muscolare, portando a una ridotta aspettativa di vita. Ad oggi, non sono stati sviluppati trattamenti mirati e gli approcci terapeutici sono limitati ad alleviare i sintomi della malattia⁷. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti coinvolti nell’insorgenza di questa malattia è cruciale per lo sviluppo di strategie terapeutiche appropriate ^6,8. Precedenti lavori che utilizzano il topo dy^{W 9}, un modello per LAMA2-CMD, suggeriscono che l’insorgenza della malattia inizia in utero, in particolare durante la miogenesi fetale¹⁰. Una migliore comprensione di come emerge il difetto della miogenesi fetale sarebbe un punto di svolta nella generazione di nuovi approcci terapeutici per LAMA2-CMD.

I sistemi in vitro forniscono un ambiente controllato per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, ma i modelli di coltura 2D mancano della complessità dei tessuti nativi. La decellularizzazione dei tessuti produce scaffold ECM acellulari specifici per il tessuto e lo stadio di sviluppo che imitano in modo più accurato il microambiente cellulare naturale rispetto ai modelli 2D e agli scaffold ingegnerizzati / sintetici. Le matrici decellularizzate (dECM) hanno il potenziale di preservare i segnali molecolari e meccanici del tessuto ospite, rendendoli migliori modelli alternativi per la comprensione dei processi in vivo ¹¹.

Esistono varie tecniche, reagenti e condizioni che possono essere utilizzate per la decellularizzazione^12,13. In questo studio, un protocollo di decellularizzazione per il cuore fetale di topo, descritto da Silva et al.14,15, è adattato al muscolo scheletrico fetale del topo e si trova a conservare tutti i componenti ECM testati (laminina α2, laminine totali, fibronectina^, collagene I e collagene IV). Il protocollo prevede tre fasi: lisi cellulare mediante shock osmotico (tampone ipotonico), dissoluzione della membrana plasmatica e dissociazione proteica (0,05% sodio dodecilsolfato [SDS]) e distruzione enzimatica del DNA (trattamento con DNasi). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo stabilito per decellularizzare il muscolo scheletrico fetale del topo.

Per utilizzare questo sistema 3D in vitro per lo studio di LAMA2-CMD, è fondamentale mantenere la catena α2 della laminina dopo la decellularizzazione. Pertanto, è stato implementato un protocollo di ottimizzazione in cui sono stati testati diversi detergenti (SDS e Triton X-100) e concentrazioni (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) (dati non mostrati). La scelta ottimale per la rimozione cellulare e la conservazione della proteina laminina α2 è risultata essere lo 0,05% di SDS. Le cellule C2C12, una linea cellulare di mioblasti ben consolidata^16,17, sono state utilizzate per seminare i dECM. Queste cellule invadono la dECM, proliferano e si differenziano all’interno di questi scaffold, sintetizzando nuove proteine ECM. Il successo della produzione di questo modello 3D in vitro offre un nuovo approccio alla comprensione dei processi molecolari e cellulari coinvolti nella miogenesi fetale, l’insorgenza di LAMA2-CMD e può essere esteso ad altre malattie muscolari di cui la comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche viene interrotta.