Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas
Summary
El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son una población heterogénea de vesículas de membrana liberadas por las células in vitro e in vivo. Su omnipresencia y su importante papel como portadores de información biológica los convierten en objetos de estudio intrigantes, que requieren protocolos confiables y repetitivos para su aislamiento. Sin embargo, darse cuenta de todo su potencial es difícil ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su investigación (como la adquisición adecuada). Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento de EVs pequeñas (según la nomenclatura MISEV 2018) a partir del sobrenadante de cultivo de líneas celulares tumorales basado en centrifugación diferencial. El protocolo incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de EV y cómo evaluarlas adecuadamente. La contaminación por endotoxinas de los vehículos eléctricos puede obstaculizar significativamente los experimentos posteriores o incluso enmascarar sus verdaderos efectos biológicos. Por otro lado, la presencia pasada por alto de endotoxinas puede llevar a conclusiones incorrectas. Esto es de particular importancia cuando se refiere a las células del sistema inmune, incluidos los monocitos, porque los monocitos constituyen una población que es especialmente sensible a los residuos de endotoxinas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente detectar la contaminación por endotoxinas en los EV, especialmente cuando se trabaja con células sensibles a las endotoxinas, como monocitos, macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides o células dendríticas.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV), según la nomenclatura MISEV 2018, son un término colectivo que describe varios subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos y patológicos 1,2. Además, los vehículos eléctricos son prometedores como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades, así como como agentes terapéuticos y vehículos de administración de fármacos. Sin embargo, realizar todo su potencial es difícil, ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su adquisición3. Uno de esos desafíos es el aislamiento de EV libres de endotoxinas, que se ha descuidado en muchos casos. Una de las endotoxinas más comunes es el lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de las paredes celulares bacterianas gramnegativas y puede causar una respuesta inflamatoria aguda, debido a la liberación de un gran número de citoquinas inflamatorias por varias células 4,5. LPS induce una respuesta mediante la unión a la proteína de unión a LPS, seguida de la interacción con el complejo CD14/TLR4/MD2 en las células mieloides. Esta interacción conduce a la activación de vías de señalización dependientes de MyD88 y TRIF, que a su vez desencadenan el factor nuclear kappa B (NFkB). La translocación de NFkB al núcleo inicia la producción de citoquinas6. Los monocitos y macrófagos son altamente sensibles al LPS, y su exposición al LPS resulta en una liberación de citoquinas inflamatorias y quimiocinas (por ejemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 y TNF-α)7,8. La estructura CD14 permite la unión de diferentes especies de LPS con afinidad similar y sirve como co-receptor para otros receptores tipo toll (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 y 9)6. El número de estudios que se están realizando sobre los efectos de las EV en monocitos/macrófagos sigue aumentando 9,10,11. Especialmente desde la perspectiva del estudio de las funciones de los monocitos, sus subpoblaciones y otras células inmunes, la presencia de endotoxinas e incluso su presencia enmascarada en EV es de gran importancia12. La contaminación pasada por alto de los vehículos eléctricos con endotoxinas puede llevar a conclusiones engañosas y ocultar su verdadera actividad biológica. En otras palabras, trabajar con células monocíticas requiere confianza en ausencia de contaminación por endotoxinas13. Las fuentes potenciales de endotoxinas pueden ser agua, medios y sueros obtenidos comercialmente, componentes y aditivos de medios, cristalería de laboratorio y artículos de plástico 5,14,15.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para el aislamiento de EV con bajo contenido de endotoxinas. El protocolo proporciona consejos simples sobre cómo evitar la contaminación por endotoxinas durante el aislamiento de EV en lugar de eliminar las endotoxinas de EV. Anteriormente, se han presentado muchos protocolos sobre cómo eliminar endotoxinas de, por ejemplo, nanopartículas diseñadas utilizadas en nanomedicina; sin embargo, ninguno de ellos es útil para estructuras biológicas como los EV. La despirogenación efectiva de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante enjuague con etanol o ácido acético, calentamiento a 175 °C durante 3 h, irradiación γ o tratamiento con tritón X-100; sin embargo, estos procedimientos conducen a la destrucción de los vehículos eléctricos16,17.
El protocolo presentado es un estudio pionero centrado en evitar las impurezas de endotoxinas en las EV, a diferencia de estudios previos sobre el efecto de las EV en los monocitos9. La aplicación de los principios propuestos a la práctica de laboratorio puede ayudar a obtener resultados de investigación confiables, lo que puede ser crucial cuando se considera el uso potencial de EV como agentes terapéuticos en la clínica12.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los últimos años, los métodos para el aislamiento adecuado de los vehículos eléctricos se han vuelto cada vez más importantes, lo que permite sus análisis más confiables, por ejemplo, en el contexto de la obtención de datos ómicos y funcionales confiables24. Con base en la experiencia de investigación previa, parece que no solo el tipo de método de aislamiento, sino también otras condiciones durante este procedimiento pueden ser importantes. El uso de FBS sin EV es ampliamente reco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia, número de subvención 2019/33 / B / NZ5 / 00647. Nos gustaría agradecer al profesor Tomasz Gosiewski y Agnieszka Krawczyk del Departamento de Microbiología Médica Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jagiellonian por su inestimable ayuda en la detección de ADN bacteriano en EV.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
Riferimenti
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
