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Ambiente

अपशिष्ट जल और वायु नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का परिमाणीकरण और संपूर्ण जीनोम लक्षण वर्णन

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की मात्रा निर्धारित करना है, जिसका उपयोग अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान अध्ययन के लिए किया जाएगा और इनडोर और आउटडोर एरोसोल में सार्स-सीओवी-2 के जोखिम जोखिम का आकलन करना है। यह प्रोटोकॉल सार्स-सीओवी-2 पूरे जीनोम लक्षण वर्णन के लिए एक टाइल्ड एम्प्लिकॉन लॉन्ग-टेम्प्लेट अनुक्रमण दृष्टिकोण का भी वर्णन करता है।

Abstract

अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान कई देशों में सार्स-सीओवी-2 और अन्य संक्रामक रोगों के लिए एक आशाजनक और प्रभावोत्पादक निगरानी प्रणाली के रूप में उभरा है। इस प्रक्रिया में आमतौर पर अपशिष्ट जल एकाग्रता, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, चयनित जीनोमिक खंडों का प्रवर्धन और प्रवर्धित जीनोमिक खंड का पता लगाना और परिमाणीकरण शामिल होता है। इसी तरह हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 जैसे संक्रामक एजेंटों का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने के लिए इस पद्धति का लाभ उठाया जा सकता है. प्रारंभ में, सार्स-सीओवी-2 को मुख्य रूप से बोलने, छींकने, खांसने, गाने या सांस लेने के दौरान संक्रमित व्यक्ति द्वारा उत्पन्न बूंदों के साथ निकट व्यक्तिगत संपर्क के माध्यम से फैलने के लिए माना गया था। हालांकि, कई अध्ययनों ने स्वास्थ्य सुविधाओं की हवा में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की उपस्थिति की सूचना दी है, जो वायरस के लिए एक व्यवहार्य मार्ग के रूप में हवाई संचरण को स्थापित करता है। यह अध्ययन अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों दोनों से वायरस के पर्यावरणीय पहचान, परिमाणीकरण और अनुक्रमण की सुविधा के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का एक समग्र प्रस्तुत करता है।

Introduction

दिसंबर 2019 में, सीओवीआईडी -19 नामक एक नई बीमारी सामने आई, जो पहले से अज्ञात कोरोनावायरस, सार्स-सीओवी-21 के कारण हुई थी। परिणामस्वरूप वैश्विक महामारी ने दुनिया भर में नैदानिक और सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत की है, क्योंकि बड़ी संख्या में व्यक्तियों को समुदाय में वायरस संचरण और प्रसार का सही आकलन करने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है। हालांकि, कई क्षेत्रों में, समय पर और स्थानिक रूप से व्यापक तरीके से परीक्षण के आवश्यक स्तर को प्राप्त करना आर्थिक रूप से असंभव है। व्यक्तिगत नैदानिक निदान पर आधारित वर्तमान निगरानी प्रणाली लक्षण गंभीरता और व्यक्तिगत रिपोर्टिंग पर बहुत अधिक निर्भर करती है, साथ ही साथ ये लक्षण4,5,6,7,8,9,10 की आबादी में प्रसारित मौजूदा बीमारियों के साथ किस हद तक ओवरलैप होते हैं। नतीजतन, बिना लक्षण वाले मामलों की एक बड़ी संख्या बीमारी के बोझको कम करके 7,11 करने में योगदान देती है।

इन चुनौतियों के कारण, कोविड-19 निगरानी के लिए अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान (डब्ल्यूबीई) को पूरक निगरानी रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया था। डब्ल्यूबीई को पहली बार 200112 में वर्णित किया गया था, और शुरू में कोकीन और अन्यअवैध दवाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण इस धारणा पर निर्भर करता है कि किसी भी पदार्थ की प्रारंभिक एकाग्रता की गणना करना संभव है जो अपशिष्ट जल में स्थिर है और मनुष्यों द्वारा उत्सर्जित 8,12 है। डब्ल्यूबीई को सार्स-सीओवी-2 3,8,14,15,16 के लिए पूरक और कुशल निगरानी प्रणाली के रूप में कई देशों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। जलीय वातावरण में मानव वायरस का पता लगाने के अधिकांश तरीके इन चरणों का पालन करते हैं: एकाग्रता, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, चुने गए जीनोमिक खंड (या खंडों) का प्रवर्धन, और प्रवर्धित जीनोमिक खंडका पता लगाना /

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और मात्रा का निर्धारण करने के लिए एक और महत्वपूर्ण वातावरण हवा के नमूनों में है। प्रारंभ में, सार्स-सीओवी-2 को मुख्य रूप से बोलने, छींकने, खांसने, गानेया सांस लेने के दौरान संक्रमित व्यक्ति द्वारा उत्पन्न एरोसोल से श्वसन बूंदों के साथ घनिष्ठ व्यक्तिगत संपर्क के माध्यम से प्रेषित किया गया था। हालांकि, कई अध्ययनों ने हवा में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की उपस्थिति की रिपोर्ट करना शुरू कर दिया, विशेष रूप से स्वास्थ्य सुविधाओं और अन्य संलग्न स्थानोंमें 18,19,20,21. अस्पतालों और अन्य संलग्न स्थानों में घर के अंदर लिए गए हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 की व्यवहार्यता के सबूत पाए गए हैं, जब वायरस की सांद्रतापर्याप्त रूप से 22,23,24 थी। बाहरी अध्ययनों में आम तौर पर सार्स-सीओवी-2 का कोई सबूत नहीं मिला है, सिवाय भीड़-भाड़ वाले बाहरी स्थानों 21,25,26,27,28,29 के। अब तक, सार्स-सीओवी-2 के हवाई संचरण को संचरणके एक मोड के रूप में मान्यता दी गई है। एक हालिया समीक्षा अध्ययन बाहर के बीच अंतर को दर्शाता है, जहां भीड़भाड़ वाले क्षेत्रों के बाहर और घर के अंदर हवाई संचरण के जोखिम न्यूनतम हैं, जहां खराब हवादार वातावरण में बड़े जोखिम मौजूद हो सकते हैं जिसमें मजबूत स्रोत (यानी, संक्रमित लोगों की संख्या) मौजूद हो सकते हैं। हाल ही में एक व्यापक समीक्षा अध्ययन ने बाहरी बनाम इनडोर वातावरण में हवाई संचरण के जोखिमों के बीच पर्याप्त अंतर पर प्रकाश डाला है, विशेष रूप से खराब वेंटिलेशन वाले भीड़-भाड़ वाले क्षेत्रों में। अध्ययन से संकेत मिलता है कि बाहरी वातावरण में हवाई संचरण का जोखिम न्यूनतम है, जहां वायरसके कणों के कमजोर पड़ने और फैलाव के लिए हवा की एक बड़ी मात्रा उपलब्ध है। इन निष्कर्षों का कोविड-19 से संबंधित सार्वजनिक स्वास्थ्य नीतियों और दिशानिर्देशों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इनडोर और आउटडोर वातावरण के बीच संचरण जोखिमों में महत्वपूर्ण अंतर को पहचानकर, नीति निर्माता वायरस के प्रसार को कम करने और सार्वजनिक स्वास्थ्य की रक्षा के लिए अधिक प्रभावी रणनीति विकसित कर सकते हैं।

विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों से सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने, मात्रा का निर्धारण और अनुक्रमण के लिए कई तरह के तरीके और प्रोटोकॉल हैं। इस विधि लेख का उद्देश्य अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का एक संयोजन प्रस्तुत करना है जो विभिन्न क्षमता स्तरों वाली प्रयोगशालाओं को अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों से वायरस का पर्यावरणीय पता लगाने, परिमाणीकरण और अनुक्रमण करने की अनुमति देता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को कहीं और प्रकाशित किया गया है और इसमें मूल विधियों से छोटे संशोधन शामिल हैं। 1. अपशिष्ट जल संग्रह और नमूना पूर्व प्रसंस्करण नोट: पर्यावरणीय नमूनों म?…

Representative Results

तालिका 3 में सारांशित परिणाम इस लेख में वर्णित विधि का उपयोग करके अपशिष्ट जल और हवा के नमूनों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने और परिमाणीकरण के उदाहरण दिखाते हैं। अपशिष्ट जल के नमूने स्पेन और स…

Discussion

(आरटी-) क्यूपीसीआर विधियों का उपयोग करके माइक्रोबियल और वायरल का पता लगाने और परिमाणीकरण ने अपनी उल्लेखनीय संवेदनशीलता के कारण व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है। हालांकि, पर्यावरणीय नमूनों का विश्लेषण क…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम कैस्टिला वाई लियोन की क्षेत्रीय सरकार और फेडर कार्यक्रम (परियोजना सीएलयू 2017-09, यूआईसी 315 और VA266P20) से वित्तीय सहायता के साथ किया गया था।

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
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Riferimenti

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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
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