Her presenterer vi en metode for langsiktig ytelse og sikkerhetsvurdering av myke subdurale elektrodearrays i en minigrismodell, som beskriver kirurgisk metode og verktøy, postoperativ magnetisk resonansavbildning, elektrofysiologi av hørselsbarken, implantatets elektrokjemiske egenskaper og postmortem immunokjemi.
Nevrologiske funksjonsnedsettelser og sykdommer kan diagnostiseres eller behandles ved hjelp av elektrokortikografi (ECoG) arrays. Ved medikamentresistent epilepsi bidrar disse til å avgrense den epileptiske regionen til resekter. I langsiktige applikasjoner som hjerne-datamaskingrensesnitt, brukes disse epikortiske elektrodene til å registrere hjernens bevegelsesintensjon, for å kontrollere robotlemmer av lammede pasienter. Dagens stive elektrodegitter svarer imidlertid ikke på behovet for høyoppløselige hjerneopptak og langsiktig biointegrasjon. Nylig har konforme elektroderader blitt foreslått for å oppnå langsiktig implantatstabilitet med høy ytelse. Det er imidlertid nødvendig med prekliniske studier for disse nye implantatteknologiene for å validere deres langsiktige funksjonalitet og sikkerhetsprofil for oversettelse til humane pasienter. I denne sammenheng brukes svinemodeller rutinemessig i utviklingen av medisinsk utstyr på grunn av deres store organstørrelser og enkle dyrehåndtering. Imidlertid er bare noen få hjerneapplikasjoner beskrevet i litteraturen, hovedsakelig på grunn av kirurgiske begrensninger og integrering av implantatsystemet på et levende dyr.
Her rapporterer vi metoden for langtidsimplantasjon (6 måneder) og evaluering av myke ECoG-arrays i minigrismodellen. Studien presenterer først implantatsystemet, som består av en myk mikrofabrikert elektrodegruppe integrert med en magnetisk resonans imaging (MRI) -kompatibel polymer transdermal port som huser instrumenteringskontakter for elektrofysiologiske opptak. Deretter beskriver studien den kirurgiske prosedyren, fra subdural implantasjon til gjenoppretting av dyr. Vi fokuserer på hørselsbarken som et eksempel på et målområde der fremkalte potensialer induseres av akustisk stimulering. Vi beskriver til slutt en datainnsamlingssekvens som inkluderer MR av hele hjernen, implantatelektrokjemisk karakterisering, intraoperativ og fritt bevegelig elektrofysiologi og immunhistokjemifarging av de ekstraherte hjernene.
Denne modellen kan brukes til å undersøke sikkerheten og funksjonen til ny design av kortikale proteser; obligatorisk preklinisk studie for å se for seg oversettelse til menneskelige pasienter.
Nevrologiske funksjonsnedsettelser og sykdommer kan diagnostiseres eller behandles ved hjelp av elektrokortikografi (ECoG) arrays. Disse elektrodegitterne er implantert på overflaten av hjernen og tillater opptak eller stimulering av den menneskelige cortex1. I tilfelle av stoffresistent epilepsi, for eksempel, bidrar de til å avgrense den epileptiske regionen for å resektere2. I langsiktige applikasjoner som hjerne-datamaskingrensesnitt, brukes disse epikortikale elektrodene til å registrere hjernens bevegelsesintensjon, for å kontrollere robotlemmer av lammede pasienter3. Imidlertid er nåværende elektrodegitter laget av stive metallblokker innebygd i stive polymere substrater og svarer ikke på behovet for høyoppløselige hjerneopptak og langsiktig subdural biointegrasjon (>30 dager). Snarere skaper de lokale vevsreaksjoner som fører til fibrotisk innkapsling av den implanterte enheten, noe som fører til dårligere ytelse over tid. Nylig har fleksible eller strekkbare elektroderader ved bruk av tynne polymere substrater produsert ved mikrofabrikasjonsteknikker blitt foreslått for å oppnå høy ytelse i langsiktige implantasjoner ved å begrense vevsreaksjonen 4,5. Det er imidlertid behov for prekliniske studier for disse nye implantatteknologiene for å validere deres langsiktige funksjonalitet og sikkerhetsprofil, slik at oversettelse til menneskelige pasienter kan tenkes. I denne sammenheng brukes minigris- og grisemodeller rutinemessig i utviklingen av enheter i andre medisinske sammenhenger (f.eks. kardiovaskulære, skjelett- eller magesystemer) på grunn av deres store organstørrelser og enkel dyrehåndtering 6,7,8. Imidlertid er bare noen få applikasjoner rettet mot hjernen for nevrofysiologi beskrevet i litteraturen, hovedsakelig på grunn av kirurgiske tilnærmingsbegrensninger og integrering av implantatsystemet på et levende dyr 9,10,11,12. Disse er ofte ikke kompatible med kronisk implantasjon i levende dyr, da de for eksempel vil kreve utvikling av kompleks maskinvare som implanterbar innebygd elektronikk. I tillegg undersøker de ikke implantatsystemets innflytelse på målvevet, noe som er avgjørende for biosikkerhetsaspektet i translasjonsstudier. Svinemodellen er nær menneskelig anatomi når det gjelder kortikal struktur, skallebein og hudtykkelse13. Videre gjør deres evne til å lære atferdsoppgaver dem til en kraftig modell for å undersøke funksjonelle rehabiliteringsstrategier eller sensoriske oppfatninger14.
Oversettelse av ny teknologi og behandling til mennesker nødvendiggjør vurdering av sikkerhet og effekt, slik det kreves av kompetente medisinske myndigheter. Disse er vanligvis beskrevet i tekniske dokumenter og normer15, men de krever bare bestått av disse testene og undersøker ikke den faktiske effekten av enhetens implantasjon eller innsamling av andre nyttige data parallelt med sikkerhetsstudien. For en komplett biosikkerhets- og ytelsesstudie på hjernen, presenterer vi her en longitudinell og systematisk samling av hjerneavbildningsdata, elektrofysiologiske målinger, vurdering av elektrokjemiske egenskaper til de implanterte elektrodene og post mortem histologi i en svinemodell. For å oppnå dette må flere aspekter vurderes for å skape en komplett eksperimentell modell: (i) minimal invasiv kirurgisk tilgang for enhetsimplantasjon sammen med en mekanisk stabil transdermal port for tilkobling til elektrodene, (ii) et robust elektrofysiologisk opptaksparadigme som fungerer som ytelsesutgang for de implanterte elektrodene både under anestesi og under fritt bevegelige forhold, (iii) in vivo avbildning (datastyrt tomografi [CT] og/eller magnetisk resonansavbildning [MRI]) på forskjellige tidspunkter for å følge utviklingen av hjernen og implantatet, samt kompatibiliteten til det implanterte systemet med bildeutstyret, og (iv) en vevsforberedelsesrørledning for å trekke ut hjernen for histologisk analyse.
Her rapporterer vi om metoden for langtidsimplantasjon (6 måneder) og evaluering av myke ECoG-arrays i minigrismodellen (vist skjematisk i figur 1). De myke elektrodearrayene ble presentert i våre tidligere rapporter og er laget av tynne silikonmembraner som legger inn elastiske gulltynne filmer brukt som elektriske spor 16,17. Kontakten med vevet er laget gjennom en blanding av platina nanopartikler innebygd i en silikonmatrise for et mykt og effektivt elektrokjemisk grensesnitt til hjernevevet18. Implantatene er koblet gjennom en fleksibel kabel tunnelert subduralt gjennom skallen og huden til en transdermal port som huser kontaktene på dyrets hode. Størrelsen og formen på implantatet kan tilpasses i henhold til målet og behovene til studien. De nåværende elektrodestrimlene i denne studien speiler den virkelige størrelsen på de kliniske strimlene. Klinisk tilgjengelige subdurale strimler og rutenett ble brukt som komparatorer med samme tilnærming. Den polymere MR-kompatible transdermale porten er plassert på skallen ved hjelp av et fotplatesystem som forankrer den fast til skallen. Her beskriver vi i detalj den kirurgiske prosedyren, fra subdural implantasjon av begge halvkule til utvinning av dyret. Vi fokuserer på hørselsbarken som et eksempelmålområde, hvor fremkalte potensialer induseres av akustisk stimulering både i bedøvede og fritt bevegelige forhold. På forskjellige tidspunkter avbildes dyrets hjerne i MR (eller CT for de kliniske elektrodene) under anestesi og elektrodenes elektrokjemiske egenskaper måles. Elektrodekarakteriseringsmetoder brukes til å følge utviklingen av implantatet og elektrodevevgrensesnittet (se Schiavone et al.19 for flere detaljer). Disse inkluderer kronoamperometri for å undersøke stimuleringsevnen til elektrodekontakten, elektrokjemisk impedansspektroskopi (EIS) som kan indikere utviklingen av de resistive og kapasitive komponentene i elektroden, og interkanalmotstandsmålinger for å undersøke for hermetiske innkapslingsfeil. Til slutt har vi utviklet en vevsekstraksjonsrørledning for å perfusere hjernen etter eutanasi, eksplantere den med elektrodene på plass, seksjonere den og utføre histologisk analyse ved hjelp av forskjellige betennelsesmarkører. Samlet sett vil denne metoden tillate prekliniske studier med robust multimodal datainnsamling for fremtidig klinisk oversettelse av ny teknologi og terapier på hjernen.
Vi rapporterer her en metode for langsiktig implantasjon og evaluering av myke ECoG-arrayer. I denne studien har vi designet en konsistent, minimalt invasiv kirurgisk tilnærming for bilateral implantasjon av funksjonelle elektrodegitter over tinninglappene (her rettet mot hørselsbarken). Vi evaluerte først funksjonaliteten til nettet ved vellykket registrering av fremkalte potensialer i løpet av studien (6 måneder) og sporing av elektrokjemiske egenskaper til elektrodene (se figur 6). For det andre vurderte vi biosikkerheten til nettene, in vivo ved å bruke MR og etablere et fullt MR-kompatibelt system, og post mortem ved å designe en protokoll for vevsinnsamling og immunfarging.
For å minimere invasivitet optimaliserte vi størrelsen på kraniotomivinduet. For å nå hørselsbarken som ligger på tinninglappen og for å unngå resektering av tinningmuskelen, har vi utviklet en teknikk for å skyve implantatet under duraen. Denne teknikken gjør det mulig å drastisk redusere overflaten av den eksponerte hjernen og fortsatt nå langt unna mål. Selv om denne typen implantasjon kan virke blind, tillater implementeringen av røntgentette markører på enhetene som visualiseres i det intraoperative planet røntgen verifisering av posisjonering, og sikrer at arrayet ikke brettes under dura materen. Subduralglidningen har vist seg å være trygg i de fleste repetisjonene vi har utført. I tillegg minimerer durotomi i en spaltetilnærming hjernebuking i løpet av tiden kraniotomien er åpen og letter lukkingen rundt implantatet uten å kreve ekstra materiale som kunstig dura mater, noe som kan forstyrre den inflammatoriske responsen. Til slutt er styrken til denne kirurgiske tilnærmingen dens evne til å bli overført til forskjellige kortikale regioner. Å leke med koordinater, kraniotomiposisjonen og enhetsstørrelsen, som alle kan justeres, gjør at denne metoden kan målrette mot det meste av cortexområdet.
Den kirurgiske metoden som presenteres her, sammen med funksjonsvurdering og undersøkelse av biointegrasjonen over tid, er ikke begrenset til mykelektrodeteknologien som er brukt i denne rapporten. Andre subdurale elektroder som utvikles for menneskelig oversettelse kan evalueres med samme protokoll. Styrken til denne metoden er avhengig av det faktum at de fleste brikkene, for eksempel kabelen og sokkelen, er modulære, personlige og kan tilpasses den spesifikke enheten som testes. I tillegg kan intrakortikale eller dype penetrerende sonder også brukes i stedet for eller i kombinasjon med subdurale elektroder, da dette bare krever justering av kraniotomi og durotomi geometri. De langsiktige resultatene kan da sammenlignes med deres kliniske kolleger, som vi har gjort her.
En av de største begrensningene i den presenterte metoden er tilstedeværelsen av skallen bihuler i minipigs, som utvikler seg i løpet av det første året12. I den forbindelse inkluderer viktige aspekter å ta hensyn til implantasjonsalderen og også størrelsen på dyret. Å utføre kraniotomier i den voksne skallen bryter bihulenes integritet og fører til høy risiko for alvorlig infeksjon i kroniske innstillinger. Slike bihuler er synlige i planrøntgen og CT-skanning preoperativt. På den annen side er det heller ikke optimalt å utføre kronisk implantasjon for tidlig, i et dyr som er for lite, når skallen gjennomgår massiv vekst og ombygging. Vi antydet at disse “hodeskallebevegelsene” etter operasjonen kunne føre til at implantatet beveger seg og bretter seg, noe som til slutt er skadelig for eksperimentet. Vi har her funnet ut at Göttingen minigriser, ca. 5-6 måneder gamle (og 8 kg) på implantasjonstidspunktet, skal gi de beste resultatene.
For å evaluere ytelsen til den implanterte ECoG for elektrofysiologiske registreringer, har vi satt opp en hurtigprotokoll for opptak av auditivt fremkalt potensial (AEP) som kan brukes i fritt bevegelige dyr og under sedasjon. Den består av å presentere en rekke akustiske toneutbrudd på bestemte frekvenser i løpet av noen få minutter. Fordelen med en slik protokoll er at den kan stilles inn på den tilgjengelige lengden på opptaket ved å redusere antall frekvenser som undersøkes. En utfordring ved registrering av kortikale signaler under anestesi er at bevissthetsnivået til dyret bør tas i betraktning ved analyse og sammenligning av dataene.
Protokollen for perfusjon ble justert over tid ved observasjon av den ekstraherte hjernens kvalitet. Faktisk fant vi det lettere å kateterisere halspulsåren bare, og ikke halsvenen. Innledningsvis presenterer litteraturen metoder der halsvenen kateteriseres for å drenere avfall20. I praksis begrenser dette strømmen ut av hjernen og fører til dårligere ekstraksjon av blod og den generelle kvaliteten på perfusjonen. Ved å kutte halsvenen og la væsken slippe ut i en stor beholder der dyret ligger, øker perfusjonens effektivitet.
Vi har utviklet en robust vevsprepareringsmetode som fungerer med antistoffer som rutinemessig brukes til betennelsessporing. Vi har skilt de to halvkulene av praktiske årsaker, da halve grisens hjerne passer på standard mikroskopglass og dermed er kompatibelt med det meste av bildeutstyr som er tilgjengelig i histologilaboratorier. Ved å kutte hjernen i blokker, er direkte tilgang til interessesonen gjort mulig uten å kreve ytterligere kutting av hele hjernen eller trimming av store deler av vevet. Hjerneskivene ved 40 μm kan samles i standard brønnplater og farges på en frittflytende måte uten store protokollendringer fra andre arters immunfarginger. Full hjerneimmunfarging kan også tenkes ved å bruke for eksempel CLARITY-metoder21.
Samlet sett er denne protokollen, som dekker personlig implantatdesign til implantasjon, funksjonalitetsoppfølging og biosikkerhetsvurdering, robust og konsistent. Vi demonstrerte her muligheten til å studere hørselssystemet, men det kan transponeres for å teste andre fysiologiske funksjoner. Videre ligger styrken til metoden vår i det faktum at den ikke er begrenset til minigriser, men fullt omsettelig til andre arter som sauer, geiter eller ikke-menneskelige primater. Til en viss grad kan den også lett tilpasses rotter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra Bertarelli Foundation og SNSF Sinergia grant CRSII5_183519. Forfatterne vil også takke Katia Galan fra EPFL for hennes hjelp med å utvikle fargeprotokollen for histologien, personalet på Neural Microsystems Platform ved Wyss Center for Bio and Neuroengineering i Genève for deres hjelp med fabrikasjonsprosessene, personalet på dyreplattformen i University Medical Center (CMU) ved Universitetet i Genève (UNIGE) for dyrepleie, kirurgisk assistanse og postoperativ styring av minigrisen (John Diaper, Xavier Belin, Fabienne Fontao og Walid Habre), teammedlemmene til Center for Biomedical Imaging (CIBM) ved Universitetet i Genève (Julien Songeon, François Lazeyras, og Rares Salomir), medarbeiderne ved patologiavdelingen ved Universitetssykehuset Genève (HUG) (Sami Schranz, Francesca Versili, Ruben Soto, og Coraline Egger), og Blaise Yvert fra Université Grenobles-Alpes for hans innspill og utvekslinger om kroniske minigriseksperimenter. Forfatterne ønsker å anerkjenne hjelp fra ansatte i Neurosoft Bioelectronics SA, for deres hjelp med fabrikasjonsprosessen og for deres hjelp i minipig-eksperimentene (Benoit Huguet og Margaux Roulet).
Bone drill | BBraun | Elan 4 with GA861 handpiece | |
Bone drill bit | BBraun | Neurocutter GP204R | |
Bonewax | Ethicon | W31G | |
Catheter | Venisystems | Abbocath 14G | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
Gelfoam | Pfizer | Gelfoam | |
Insert speakers | Etymotic | Etymotic ER2 insert Earphones | |
Multimeter | Fluke | Fluke 1700 | |
Oscilloscope | Tektronix | MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope | |
Perfusion pump | Shenzen | LabS3/UD15 | |
Potentiostat | Gamry Instruments | Reference 600 | |
Primary Antibody Anti-GFAP | Thermofischer | Anti-GFAP, Rat, # 13-0300 | |
Primary Antibody Anti-Iba1 | Fujifilm | Anti Iba1, Rabbit, 019-19741 | |
Primary Antibody Anti-NeuN | SigmaAldrich | Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90 | |
Pulse Generator | AM Systems | Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | |
Recording headstage | Multichannel systems | W2100-HS32 | |
Recording system | Multichannel systems | W2100 | |
Screwdriver | Medtronic | Handle: 001201, Shaft: 8001205 | |
Secondary Antibody 488 | Thermofischer | Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006 | |
Secondary Antibody 555 | Thermofischer | Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435 | |
Secondary Antibody 647 | Thermofischer | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245 | |
Slide Scanner | Olympus | VS120 | |
Snapfrost | Excilone | Excilone Snapfrost | |
Stab knife | Fine Science Tools | 10316-14 | |
Suture wire dermal | Ethicon | Vicryl 2-0 | |
Suture wire dura mater | Ethicon | Mersilk 5-0 | |
Suture wire for catheter | Ethicon | Vycril 3-0 without needle | |
Suture wire for lifting dura | Ethicon | Prolene 6-0 with BV-1 needle | |
Suture wire subcutaneous | Ethicon | Vicryl 4-0 | |
Titanium bridge | Medtronic | TiMesh 015-2001-4 | Cut out the required size |
Titanium screws | Medtronic | 9001635, 9001640 | |
X-ray system | GE | GE OEC 9800 Plus C-Arm |