유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성
Summary
말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.
Abstract
말라리아는 기생충 플라스모디움(Plasmodium)에 의해 발생하는 치명적인 질병이며 암컷 아노펠레스 모기에 물려 전염됩니다. 척추동물 숙주의 피부에 모기에 의해 침착된 Plasmodium의 sporozoite 단계는 임상 말라리아를 시작하기 전에 간에서 필수 발달 단계를 거칩니다. 우리는 간에서 Plasmodium 발달의 생물학에 대해 거의 알지 못합니다. sporozoite 단계에 대한 접근과 이러한 sporozoite를 유전적으로 변형할 수 있는 능력은 Plasmodium 감염의 특성과 간에서 발생하는 면역 반응을 연구하는 데 중요한 도구입니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 우리는 혈액 병기 P. berghei를 유전자 변형하여 이 형태를 사용하여 Anopheles 모기가 혈액 식사를 할 때 감염시킵니다. 유전자 변형 기생충이 모기에서 발달한 후, 생체 내 및 시험관 내 실험을 위해 모기 타액선에서 기생충의 포자석 단계를 분리합니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 소단위 11(GFP11)을 발현하는 P. berghei의 새로운 균주의 sporozoites를 생성하여 프로토콜의 타당성을 입증하고 간 단계 말라리아의 생물학을 조사하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
말라리아 예방 및 치료에 대한 약물 개발과 연구의 발전에도 불구하고 말라리아로 인한 전 세계적인 질병 부담은 여전히 높습니다. 매년 50만 명 이상이 말라리아로 사망하며, 사하라 사막 이남 아프리카1과 같은 말라리아 풍토병 지역에 거주하는 어린이들의 사망률이 가장 높다. 말라리아는 플라스모디움(Plasmodium)이라는 기생충에 의해 발생하는데, 이 기생충은 침샘에 기생충을 품고 있는 암컷 아노펠레스 모기에 물려 인간에게 전염됩니다. 플라스모듐(Plasmodium)의 감염 단계인 스포로조이트(sporozoite)는 혈액 식사 중에 척추동물 숙주의 피부에 침착되어 혈류를 통해 이동하여 간세포를 감염시키고, 간세포를 감염시키기 전에 필수 발달(적혈구 전 말라리아 구성)을 거칩니다. 적혈구의 감염은 말라리아의 혈액 단계를 시작하고 질병과 관련된 이환율과 사망률 전체를 담당합니다 2,3.
플라스모디움(Plasmodium)의 적혈구 전 발달의 의무적 특성으로 인해 플라스모디움은 예방 백신 및 약물 개발 노력의 매력적인 표적이 되었습니다4. 적혈구 전단계 말라리아의 생물학을 연구하고 간 단계를 표적으로 하는 백신 또는 약물 개발을 위한 전제 조건은 Plasmodium sporozoites에 대한 접근입니다. 또한, 유전자 변형 Plasmodium sporozoites를 생성하는 우리의 능력은 그러한 연구 노력의 성공에 중요한 역할을 했습니다 5,6,7,8,9. 형광 또는 발광 리포터 단백질을 발현하는 형질전환 플라스모듐 라인은 생체 내 및 시험관 내 10,11의 발달을 추적할 수 있게 해주었습니다. Plasmodium에서 여러 유전자의 결실을 통해 생성된 유전자 약독화 기생충(GAP)도 가장 유망한 백신 후보중 일부입니다 12,13.
설치류 및 비인간 영장류 말라리아 모델은 Plasmodium 종 간의 생물학 및 생활 주기의 유사성으로 인해 인간 말라리아에서 숙주-기생충 상호 작용의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되었습니다14. 설치류는 감염시키지만 인간은 감염시키지 않는 Plasmodium 종(예: P. berghei)을 사용하면 통제된 생물안전 레벨 1 환경에서 간 단계 말라리아를 연구하기 위해 전체 기생충 수명 주기를 유지하고 감염성 포자체를 생성할 수 있습니다. 형질전환 혈액 단계 플라스모디움 기생충(Plasmodium parasites)15의 생성, 모기(mosquitoes)16의 감염 및 스포자조이트(sporozoite)17의 분리를 위한 다양한 개별 프로토콜이 이미 존재한다. 여기에서는 새로운 형질전환 균주 PbGFP11을 예로 들어 형질전환 P. berghei sporozoites를 생성 및 분리하기 위해 이러한 방법론을 결합한 포괄적인 프로토콜을 간략하게 설명합니다. PbGFP 11은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(GFP)의 11번째 β 가닥인 GFP11을 숙주 간세포에서 생성된 기생 액포(PV)로 전달합니다. PbGFP 11은 세포질(Hepa GFP 1-10 세포)에서 GFP 1-10 단편(GFP 1-10)을 구성하는 잔기를 발현하는 형질전환 간세포(Hepa1-6 배경)와 함께 사용됩니다. PbGFP11은 기능적 GFP 및 녹색 형광 신호(18)의 자기 보완 및 재형성을 통해 숙주 간세포에서 PV 용해를 보고합니다. 주목할 점은, GFP 11은 PbGFP11에서 일련의 7개의 탠덤 서열로 인코딩되어 결과 형광 신호를 향상시킨다는 것이다. 세포질 염료인 CellTrace Violet(CTV)으로 PbGFP11 sporozoites를 염색하면 기생충을 추적할 수 있습니다. 이러한 CTV 염색 세포 내 기생충의 용해 자체는 CTV가 숙주 세포 세포질로 누출되고 숙주 세포의 염색을 초래합니다. 숙주 간세포에서 Plasmodium PV 및/또는 기생충의 용해를 시각화하고 구별하는 것 외에도 이 시스템은 이러한 경로의 분자 구성 요소의 유전적 또는 치료적 섭동을 통해 이러한 과정 중 하나를 담당하는 면역 경로를 연구하는 데 안정적으로 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 실험실에서 위의 프로토콜을 사용하여 여러 계통의 형질전환 P. berghei 기생충을 만들었습니다. P. berghei에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜을 사용하여 형질전환 P. yoelii sporozoites를 생성하는 데에도 성공했습니다. 형질주입된 분열체를 마우스에 주입한 후, 기생충은 플라스미드 대조군이 없는 그룹을 포함하여 모든 그룹에서 일반적으로 3 d.p.i. 이하로 검출될 수 있다. ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 AI168307 SPK의 지원을 받았습니다. UGA CTEGD 유세포 분석 코어와 UGA CTEGD 현미경 코어에 감사드립니다. 또한 Ash Pathak, Anne Elliot, UGA Sporocore 직원들의 프로토콜 최적화에 기여한 공로를 인정합니다. 귀중한 통찰력, 토론 및 GFP11 및 GFP 1-10을 포함하는 모체 플라스미드에 대해 Daichi Kamiyama 박사에게 감사드립니다. 또한 Kurup 연구소 구성원의 끊임없는 지원, 인내, 격려에 감사드립니다.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
Riferimenti
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