Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

1. Bitki materyalinin büyümesi Mısır çekirdeklerini musluk suyuyla iki kez durulayın. Çekirdekleri gece boyunca oda sıcaklığında musluk suyuna batırın. Ertesi gün, 72 hücreli bir tohum başlangıç tepsisini ıslatılmış 1: 1 vermikülit: turba yosunu ile doldurun. Çekirdekleri bir kez durulayın ve hücre başına bir çekirdek olacak şekilde uç kapağını aşağı doğru yerleştirin. 3 gün boyunca 25 ° C’de uzun gün koşullarında (16 saat ışık, 8 saat karanlık) büyütün. 25 ° C’de sabit karanlığa geçin ve 9-11 gün boyunca büyüyün. 2. Plazmid izolasyonu Ticari kimyasal olarak yetkin E. coli’yi , üreticinin talimatlarına göre ilgili plazmid (ler) ile dönüştürün. Dönüştürülmüş E. coli’yi 50 mL sıvı LB ortamında uygun antibiyotiklerle gece boyunca 37 ° C’de çalkalama ile büyütün. E. coli’yi oda sıcaklığında 3.000 x g’de 10 dakika santrifüj yaparak pelet yapın. Ticari olarak temin edilebilen bir midiprep plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri ayıklayın. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak plazmid DNA konsantrasyonunu tahmin edin.NOT: Transfeksiyona uygun malzeme ≥800 ng/μL konsantrasyonuna ve A260/A280 konsantrasyonu ≥1.8 olmalıdır. 3. Protoplast izolasyonu 20 mL enzim çözeltisi hazırlayın.50 mL’lik bir santrifüj tüpüne 2.18 g mannitol, 0.30 g selülaz R-10 ve 0.06 g macerozyme R-10 ekleyin. Tozları karıştırmak için ters çevirin. DeiyonizeH2O ila 15 mL ekleyin. 200 μL 1 M MES, pH 5.7 ekleyin. Karıştırmak için vorteks. Çözeltiyi 55 ° C’de 10 dakika ısıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika soğutun. 20 μL 1 M CaCl2, 0.02 g sığır serum albümini ve 100 μL 1 M β-merkaptoetanol ekleyin. Deiyonize H2O ile 20 mL’ye kadar doldurun Folyo sarılı 250 mL beher içine dökün. Mısır fidelerini karanlıktan çıkarın. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak onları toprağın birkaç santimetre yukarısında kesin. Kesilen uçları suya yerleştirin. Kullanmadığınız zamanlarda oda sıcaklığında karanlıkta saklayın. Her fidenin ikinci ve üçüncü yapraklarını seçin, kahverengi veya hasarlı alanlara sahip yaprakları dışlamaya özen gösterin. 12-16 yaprak seçin. Her yaprağın ucundan ~ 1 cm kesin ve atın. Ardından, her yapraktan 10 cm’lik bir bölüm kesin.NOT: Daha fazla dokuya ihtiyaç duyulursa, ilave 250 mL’lik bir beherde ilave 20 mL hacimli enzim çözeltisi kullanın. Belirli miktarda enzim çözeltisindeki çok fazla yaprak materyali canlılığı azaltabilir. Yaprak bölümlerini bazal uçları birlikte olacak şekilde üst üste istifleyin. Bir bağlayıcı klips kullanarak demeti bazal uçta birbirine kenetleyin. Yaprak demetini bir parça beyaz kağıda yerleştirin. Yaprakları distal uçtan ~ 1 cm tutun. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak, yaprakları damarlara dik olan distal uçtan ince (0,5-1 mm) dilimler halinde kesin. Düz bir şekilde doğramaktan kaçının, bunun yerine doku boyunca kısa, ileri dilimler yapın.Kağıda görünür kalıntı birikmeye başladığında tıraş bıçağını değiştirin. Görünür kalıntı, donuk bir bıçak veya zayıf bir teknik nedeniyle dokunun ezildiğini gösterir. Yaprak demetinin uzunluğunun ~ 2 cm’sini kestikten sonra, dilimleri derhal enzim çözeltisinin kabına aktarın. Malzemenin kurumasına izin vermeyin, çünkü bu elde edilen protoplast sayısını azaltacaktır. Malzemeyi ıslatmak için enzim çözeltisini yavaşça döndürün.Işığı engellemek için beherin üzerine bir folyo kapağı yerleştirin. Tüm demet bağlayıcı klipse yakın kesilene kadar dilimleme ve aktarma işlemini tekrarlayın. Enzim çözeltisinin kabını bir çan kavanozuna aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ortam basıncına göre -50,8 kPa ile -67,7 kPa arasında vakum sızması. Beher’i bir masa üstü çalkalayıcıya aktarın. Oda sıcaklığında 40 RPM’de 2,5 saat çalkalayın. Beheri elle yavaşça döndürün. Tamamen sindirildiğinde, enzim çözeltisi hafif sütlü görünecektir. Çözüm hala açıksa, 40 RPM’de bir saate kadar sallamaya devam edin. 3,5 saati aşmayın. Sindirim sırasında, bir mannitol + MES + MgCl2 (MMG) çözeltisi, bir polietilen glikol (PEG) çözeltisi ve bir inkübasyon çözeltisi yapın.MMG: 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne 5.47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5.7 ve 750 μL 1 M MgCl2 ekleyin. Çözünmesi için damıtılmışH2O. Vorteks ile 50 mL’ye kadar doldurun. Buzun üzerine yerleştirin. Kuluçka çözeltisi: 5.47 g mannitol, pH 5.7’de 200 μL 1 M MES ve 50 mL santrifüj tüpüne 200 μL 1 M KCl ekleyin. Çözünmesi için damıtılmışH2O. Vorteks ile 50 mL’ye kadar doldurun. Buzun üzerine yerleştirin. PEG çözeltisi: 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG ve 400 μL 1 M CaCl2 ekleyin. Karıştırmak için damıtılmışH2O. Vorteks ile 4 mL’ye kadar doldurun. Tamamen eriyene kadar 30 dakika çalkalayarak 37 ° C’de inkübe edin. Oda sıcaklığında muhafaza ediniz. Enzim çözeltisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 80 RPM’de çalkalayın. Beheri enzim çözeltisi ile buz üzerine yerleştirin. Folyo kaplamayı çıkarmayın. Enzim çözeltisine 20 mL buz gibi soğuk MMG ekleyin. 40 μm’lik bir hücre süzgecinden 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.NOT: PEG eklenene kadar aşağıdaki adımlar için tüm çözeltileri buz üzerinde tutun. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için protoplastları folyo ile kaplı tutun. Filtratı her biri 10 mL’lik eşit hacimlere bölün. Her hacmi yuvarlak tabanlı bir cam santrifüj tüpüne dökün ve oda sıcaklığında 100 x g’de 4 dakika aşağı çevirin. Süpernatantı atın ve her tüpe 1 mL buz gibi soğuk MMG ekleyin. Peletleri hafifçe döndürerek ve tüplere dokunarak tekrar askıya alın. Numuneleri tek bir yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpünde birleştirin. MMG’yi toplam 5 mL hacme ekleyin. Oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika aşağı çevirin. 5 mL MMG ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika aşağı çevirin. Yıkamayı 5 mL MMG ile tekrarlayın ve oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika aşağı çevirin. İkinci yıkamayı döndürdükten sonra, süpernatantın açık olup olmadığını gözlemleyin. Hava bulutlu kalırsa, üçüncü bir yıkama yapın. Protoplastları 1 mL MMG’de tekrar askıya alın. Folyo ile gevşek bir şekilde örtün ve buz üzerinde tutun. Protoplast verimini belirleyin ve canlılığı kontrol edin.1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 4 μL protoplast ve 72 μL MMG’yi bir araya getirin. 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 20x çalışma çözeltisi oluşturmak için 49 μL MMG’ye 1 μL% 0,5 floresein diasetat (FDA) stok çözeltisi ekleyin. Seyreltilmiş protoplastlarla tüpe 4 μL FDA çalışma çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika inkübe edin. Protoplast karışımının 11 μL’sini bir hemositometreye yükleyin. Parlak alan ışık mikroskobunun altına yerleştirin. Hücrelerin hücre duvarlarından yoksun olduğunu görsel olarak doğrulayın. Ardından, protoplastların sayısını sayın. Elde edilen toplam protoplast sayısını tahmin etmek için bu sayıyı kullanın. Ardından, FDA ile boyandığında UV ışığı altında yeşil floresan protoplastların sayısını sayın. Başarılı protoplast izolasyonları% 70 -% 90’lık bir canlılık sağlar. 4. PEG aracılı transfeksiyon Adım 3.17’den itibaren tahmini protoplast konsantrasyonundan başlayarak, ~ 10.000 protoplast / μL’ye ayarlayın. Konsantrasyon düşükse, 100 x g’de 3 dakika santrifüj yapın ve MMG’de ~ 10.000 protoplast / μL’lik bir konsantrasyona geri askıya alın. ~ 1.000.000 protoplastı 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde 15 μg DNA ile karıştırın. Karışımı MMG ile 114.4 μL’ye kadar doldurun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüpün yan tarafına dokunarak protoplastları yeniden askıya alın. PEG nihai ağırlığa/hacme ulaşmak için protoplastlara 105.6 μL% 25 PEG çözeltisi ekleyin. 5-10 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. PEG çözeltisindeki protoplastlar kırılgandır; tüpü sallamayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.NOT: Transfeksiyon, adım 4.2 ve adım 4.3’te verilen birimlerin katları halinde ölçeklendirilebilir. Örneğin, 10 milyon protoplast ve 150 μg DNA, 1.444 μL MMG içinde askıya alınabilir ve 50 mL’lik bir santrifüj tüpünde 1.056 μL PEG çözeltisi ile muamele edilebilir. 5 hacim inkübasyon çözeltisi ile seyreltin. Ters çevirerek yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 100 x g’de 4 dakika aşağı çevirin.NOT: Ölçeği artırıyorsanız, tam peletleme sağlamak için protoplastları her biri 10 mL’den fazla olmayan birden fazla yuvarlak tabanlı cam tüpe bölün. Yıkama için kullanılan inkübasyon çözeltisi hacmini orantılı olarak artırın. Süpernatantı pipetleme ile çıkarın. 1-5 mL inkübasyon çözeltisi ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika aşağı çevirin. Protoplastları inkübasyon çözeltisinde 500-1.000 hücre / μL’lik bir konsantrasyona yeniden askıya alın. Protoplastları karanlıkta gece boyunca (~ 16 saat) oda sıcaklığında inkübe edin. 5. Protoplast kurtarma ve ifade doğrulama Protoplastları oda sıcaklığında 100 x g’de 4 dakika boyunca döndürün. NOT: Ölçeği artırıyorsanız, protoplastları her biri 10 mL’den fazla olmayan çoklu yuvarlak tabanlı cam tüplere bölün. 1-5 mL inkübasyon çözeltisi ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika aşağı çevirin. Askıya alın ve 1-5 mL inkübasyon çözeltisinde birleştirin. Protoplastlar bir floresan muhabir geni (örneğin, GFP) ile transfekte edilirse, transfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için bir aliquot alın. Bir hemositometre kullanarak, önce parlak alan ışık mikroskobu kullanarak toplam protoplast sayısını sayın. Ardından, UV ışığı altında floresan protoplastların fraksiyonunu sayın. Protoplastları oda sıcaklığında 100 x g’de 3 dakika boyunca santrifüj edin.NOT: Protoplastlar artık fenol ve guanidin izotiyosiyanat ile RNA ekstraksiyonu gibi aşağı akış uygulamaları için hazırdır.