トウモロコシ葉肉プロトプラストのスケーラブルトランスフェクション

1.植物材料の成長 トウモロコシの穀粒を水道水で2回すすいでください。カーネルを水道水に室温で一晩浸します。 翌日、72セルシードスタータートレイに濡れた1:1バーミキュライト:ピートモスを入れます。カーネルを一度すすぎ、セルごとに1つのカーネルをチップキャップダウンに植えます。 長日条件(16時間明、8時間暗)で25°Cで3日間生育する。 25°Cの一定の暗所に移し、9〜11日間増殖させる。 2. プラスミド単離 市販の化学的に有能な 大腸菌 を、製造元の指示に従って目的のプラスミドに変換します。 形質転換 大腸菌 を適切な抗生物質を含む50 mLの液体LB培地で、振とうしながら37°Cで一晩増殖させます。 室温で3,000 x gで10分間遠心分離することにより、大腸菌をペレット化します。市販のミディプレッププラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドを抽出する。 マイクロボリューム分光光度計を用いてプラスミドDNA濃度を推定する。注:トランスフェクションに適した材料は、濃度が≥800 ng/μL、A260/A280が≥1.8である必要があります。 3. プロトプラスト単離 20 mLの酵素溶液を調製します。2.18 gのマンニトール、0.30 gのセルラーゼR-10、および0.06 gのマセロザイムR-10を50 mLの遠沈管に加えます。反転して粉末を混ぜます。脱イオンH2Oを15mLに添加する。200 μLの1 M MES、pH 5.7を加えます。混合する渦。 溶液を55°Cで10分間加熱します。室温で10分間冷却する。 20 μLの1 M CaCl2、0.02 gのウシ血清アルブミン、および1 M β-メルカプトエタノール100 μLを加えます。 脱イオンH2Oを20mLまで満たし、ホイルで包んだ250mLビーカーに注ぎます。 トウモロコシの苗を暗闇から取り出します。新しいかみそりの刃を使って土の上数センチにそれらを切ります。切り口を水に入れます。使用しないときは、室温で暗所に保管してください。 茶色または損傷した領域を持つ葉を除外するように注意しながら、各苗の2番目と3番目の葉を選択します。12〜16枚の葉を選択します。各葉の先端から~1cm切り取り、廃棄します。次に、各葉から10 cmのセクションを切り取ります。注意: より多くの組織が必要な場合は、追加の20mLビーカーにさらに250mLの酵素溶液を使用します。一定量の酵素溶液中の葉の材料が多すぎると、生存率が低下する可能性があります。 基底端を一緒にして、葉のセクションを互いに積み重ねます。バインダークリップを使用して、基底端でバンドルを一緒にクランプします。葉の束を一枚の白い紙の上に置きます。 遠位端から~1 cmの葉をつかみます。新しいかみそりの刃を使用して、葉脈に垂直な遠位端から葉を薄い(0.5〜1 mm)スライスに切ります。まっすぐに切り刻むのではなく、組織を通して短く前方にスライスします。目に見える残留物が紙に堆積し始めたら、かみそりの刃を交換してください。目に見える残留物は、鈍い刃または貧弱な技術による組織のマッシングを示します。 葉束の長さを~2cmに切った後、速やかにスライスを酵素液のビーカーに移します。これは得られるプロトプラストの数を減らすので、材料を乾燥させないでください。酵素溶液を静かに回転させて材料を濡らします。光を遮断するためにビーカーの上にホイルの蓋を置きます。バンドル全体がバインダークリップの近くで切断されるまで、スライスと転送のプロセスを繰り返します。 酵素溶液のビーカーをベルジャーに移します。室温で3分間、周囲圧力に対して-50.8 kPaから-67.7 kPaの間で真空浸透させます。 ビーカーを卓上シェーカーに移します。室温で40RPMで2.5時間振とうします。ビーカーを手でそっと回転させます。完全に消化されると、酵素溶液はわずかに乳白色に見えます。それでも解決策が明確な場合は、40 RPMでさらに最大1時間振とうを続けます。3.5時間を超えないようにしてください。 消化中に、マンニトール+ MES + MgCl2 (MMG)溶液、ポリエチレングリコール(PEG)溶液、およびインキュベーション溶液を作ります。MMG:50 mLの遠沈管に5.47 gのマンニトール、200 μLの1 M MES、pH 5.7、および750 μLの1 M MgCl2 を加えます。溶解する蒸留H2O.ボルテックスで50mLまで充填する。氷の上に置きます。 インキュベーション溶液:5.47 gのマンニトール、pH 5.7で200 μLの1 M MES、および200 μLの1 M KClを50 mL遠沈管に加えます。溶解する蒸留H2O.ボルテックスで50mLまで充填する。氷の上に置きます。 PEG溶液:0.44 gのマンニトール、1.0 gのPEG、および400 μLの1 M CaCl2 を15 mLの遠沈管に加えます。蒸留H2O.ボルテックスを4mL充填して混合する。完全に溶解するまで30分間振とうしながら37°Cでインキュベートします。室温で保管してください。 酵素溶液を80RPMで室温で10分間振とうします。 酵素溶液を入れたビーカーを氷の上に置きます。ホイルカバーを取り外さないでください。20 mLの氷冷MMGを酵素溶液に加えます。40 μmのセルストレーナーを通して50 mLの遠沈管にろ過します。注意: PEGが追加されるまで、次の手順のためにすべてのソリューションを氷上に保管してください。光への露出を最小限に抑えるために、プロトプラストをホイルで覆ってください。 ろ液をそれぞれ10mLの等量に分割します。各ボリュームを丸底ガラス遠沈管に注ぎ、室温で100 x g で4分間スピンダウンします。 上清を廃棄し、各チューブに1 mLの氷冷MMGを加えます。チューブを穏やかに回転させて軽くたたくことにより、ペレットを再懸濁します。サンプルを1本の丸底ガラス製遠心チューブに結合します。MMGを総容量5 mLまで添加します。室温で100 x g で3分間スピンダウンします。 5 mLのMMGで洗浄し、室温で100 x g で3分間スピンダウンします。 5 mLのMMGで洗浄を繰り返し、室温で100 x g で3分間スピンダウンします。2回目の洗浄をスピンダウンした後、上清が透明かどうかを確認します。曇ったままの場合は、3回目の洗浄を行います。 プロトプラストを1 mLのMMGに再懸濁します。.ホイルでゆるく覆い、氷の上に置いておきます。 プロトプラスト収量を決定し、生存率を確認します。1.5 mLの微量遠心チューブに、4 μLのプロトプラストと72 μLのMMGを一緒に加えます。 1.5 mLの微量遠心チューブに、1 μLの0.5%フルオレセインジアセテート(FDA)ストック溶液を49 μLのMMGに加え、20倍の作業溶液を作ります。希釈したプロトプラストと共に4 μLのFDA作動溶液をチューブに加えます。室温で暗所で5分間インキュベートします。 11 μLのプロトプラスト混合物を血球計算盤にロードします。明視野光学顕微鏡の下に置きます。細胞が細胞壁を欠いていることを視覚的に確認します。次に、プロトプラストの数を数えます。この数を使用して、得られたプロトプラストの総数を推定します。次に、FDAで染色したときにUV光下で緑色に蛍光を発するプロトプラストの数を数えます。プロトプラスト単離が成功すると、70%〜90%の生存率が得られます。 4. PEGを介したトランスフェクション ステップ3.17の推定プロトプラスト濃度から始めて、~10,000プロトプラスト/μLに調整します。濃度が低い場合は、100 x gで3分間遠心分離し、MMGに~10,000プロトプラスト/μLの濃度まで再懸濁します。 ~1,000,000個のプロトプラストを1.5 mLの微量遠心チューブで15 μgのDNAと混合します。MMGを114.4 μLまで補充し、氷上で30分間インキュベートします。 チューブの側面をタップしてプロトプラストを再懸濁します。105.6 μLの25%PEG溶液をプロトプラストに加え、最終的な重量/容量12%PEGに到達します。5〜10回反転させて穏やかに混ぜます。PEG溶液中のプロトプラストは壊れやすい。チューブを振らないでください。室温で暗所で10分間インキュベートします。注:トランスフェクションは、ステップ 4.2 およびステップ 4.3 で示した容量の倍数でスケールアップできます。例えば、1,000万個のプロトプラストと150 μgのDNAを1,444 μLのMMGに懸濁し、50 mLの遠沈管で1,056 μLのPEG溶液で処理することができます。 5容量のインキュベーション溶液で希釈する。反転して穏やかに混ぜます。室温で100 x gで4分間スピンダウンします。注:スケールアップする場合は、プロトプラストをそれぞれ10mL以下の複数の丸底ガラス管に分割して、完全なペレット化を確保します。洗浄に使用するインキュベーション液の量を比例的にスケールアップします。 ピペッティングにより上清を除去する。1〜5 mLのインキュベーション溶液で洗浄し、室温で100 x g で3分間スピンダウンします。 プロトプラストをインキュベーション溶液に500〜1,000細胞/μLの濃度に再懸濁します。 プロトプラストを暗所で室温で一晩(~16時間)インキュベートします。 5. プロトプラスト回収と発現検証 プロトプラストを室温で100 x gで4分間スピンダウンします。注:スケールアップする場合は、プロトプラストをそれぞれ10mL以下の複数の丸底ガラス管に分割します。 1〜5 mLのインキュベーション溶液で洗浄し、室温で100 x g で3分間スピンダウンします。 再懸濁し、1〜5 mLのインキュベーション溶液に混ぜ合わせます。 プロトプラストに蛍光レポーター遺伝子(GFPなど)をトランスフェクトする場合は、アリコートを採取してトランスフェクション効率を確認します。血球計算盤を使用して、まず明視野光学顕微鏡を使用してプロトプラストの総数を数えます。次に、UV光下で蛍光プロトプラストの割合をカウントします。 プロトプラストを室温で100 x g で3分間遠心分離します。注:プロトプラストは、フェノールやグアニジンイソチオシアネートによるRNA抽出などのダウンストリームアプリケーションに対応できました。