JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Измерение митохондриального биоэнергетического профиля нейтрофилов в режиме реального времени

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Описаны ступенчатые протоколы измерения митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека и клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

Abstract

Нейтрофилы являются первой линией защиты и наиболее распространенными лейкоцитами у человека. Эти эффекторные клетки выполняют такие функции, как фагоцитоз и окислительный взрыв, и создают нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО) для микробного клиренса. Новое понимание метаболической активности нейтрофилов бросает вызов ранней концепции о том, что они в первую очередь полагаются на гликолиз. Точное измерение метаболической активности может выявить различные метаболические потребности нейтрофилов, включая цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) (также известный как цикл Кребса), окислительное фосфорилирование (OXPHOS), пентозофосфатный путь (PPP) и окисление жирных кислот (FAO) в физиологических условиях и в болезненных состояниях. В этой статье описывается пошаговый протокол и предварительные требования для измерения скорости потребления кислорода (OCR) в качестве индикатора митохондриального дыхания на нейтрофилах, полученных из костного мозга мыши, нейтрофилах, полученных из крови человека, и нейтрофильной клеточной линии HL60 с использованием анализа метаболического потока на анализаторе метаболического внеклеточного потока. Этот метод может быть использован для количественной оценки митохондриальных функций нейтрофилов в норме и при заболеваниях.

Introduction

Митохондрии играют важную роль в биоэнергетике клеток, которая генерирует аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В дополнение к этому, роль митохондрий распространяется на генерацию и детоксикацию активных форм кислорода, цитоплазматическую и митохондриальную матриксную регуляцию кальция, клеточный синтез, катаболизм и транспорт метаболитов внутри клетки1. Митохондриальное дыхание необходимо для всех клеток, так как их дисфункция может привести к метаболическим проблемам 2, включая сердечно-сосудистые заболевания3 и широкий спектр нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация4, болезни Паркинсона и Альцгеймера5 и болезнь Шарко-Мари-Тута2 A (CMT2A)6.

Электронно-микроскопические исследования нейтрофилов показали, что митохондрий7 относительно немного, и они в значительной степени зависят от гликолиза для производства энергии, поскольку скорость митохондриального дыхания очень низкая8. Однако митохондрии имеют решающее значение для функций нейтрофилов, таких как хемотаксис9 и апоптоз10,11,12. Предыдущее исследование выявило сложную митохондриальную сеть в нейтрофилах человека с высоким мембранным потенциалом. Потеря потенциала митохондриальной мембраны является ранним индикатором апоптоза нейтрофилов10. Лечение митохондриальным разъединителем карбонильного цианида м-хлорфенилгидразоном (CCCP) показало значительное ингибирование хемотаксиса, а также изменение морфологии митохондрий 9,10.

Хотя основным источником энергии для нейтрофилов является гликолиз, митохондрии обеспечивают АТФ, которая инициирует активацию нейтрофилов, подпитывая первую фазу пуринергической передачи сигналов, которая усиливает передачу сигналов Ca2+, усиливает продукцию митохондриальной АТФ и инициирует функциональные реакции нейтрофилов13. Дисфункция митохондриальной дыхательной цепи приводит к избыточной продукции токсичных активных форм кислорода (АФК) и приводит к патогенным повреждениям14,15,16. Нетоз, который представляет собой процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НЭО), является важнейшим свойством нейтрофилов, которое помогает им бороться с патогенами17 и способствует развитию многих патологических состояний, включая рак, тромбоз и аутоиммунные расстройства18. АФК митохондриального происхождения способствуют NETosis19, митохондриальная ДНК может быть компонентом NETs18, а измененный митохондриальный гомеостаз ухудшает NETosis 20,21,22,23,24. Кроме того, во время нормальной дифференцировки или созревания метаболическое перепрограммирование нейтрофилов обращается вспять, ограничивая гликолитическую активность, и они участвуют в митохондриальном дыхании и мобилизуют внутриклеточные липиды25,26.

Анализатор метаболического внеклеточного потока может непрерывно контролировать и количественно определять митохондриальное дыхание и гликолиз живых клеток. В анализаторе используется 96-луночный картридж пластинчатого формата и два флуорофора для количественного определения концентрации кислорода (O2) и изменений pH. Сенсорный картридж находится над монослоем ячейки во время анализа и образует микрокамеру высотой ~200 нм. Пучки оптических волокон в анализаторе используются для возбуждения флуорофоров и обнаружения изменений интенсивности флуоресценции. Изменения концентрации O2 и рН в режиме реального времени автоматически рассчитываются и отображаются как скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного подкисления (ECAR). На картридже датчика имеется четыре порта, которые позволяют загружать до четырех соединений в каждую скважину во время измерений. Этот протокол фокусируется на количественной оценке митохондриального дыхания нейтрофилов мыши и человека, а также нейтрофилоподобных клеток HL60 с использованием анализатора метаболического внеклеточного потока.

Protocol

Гепаринизированные образцы цельной крови были получены от здоровых доноров после получения информированного согласия, одобренного Институциональным наблюдательным советом UConn Health в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с ?…

Representative Results

Показана репрезентативная динамика OCR, указывающая на изменения митохондриального дыхания в ответ на олигомицин, FCCP и смесь ротенона/антимицина А нейтрофилов мыши (рис. 3A), нейтрофилов человека (рис. 3B) и недифференцированных и дифференцированных клеток …

Discussion

Стандартная процедура, которая измеряет митохондриальное дыхание нейтрофилов с помощью метаболического анализатора внеклеточного потока, ограничена многими факторами, включая количество клеток, рост клеток и жизнеспособность. Концентрация каждого соединения варьируется в зависим?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы выражаем благодарность доктору Энтони Т. Велле и доктору Федерике Альяноин из отделения иммунологии UConn Health за их обучение использованию анализатора метаболического внеклеточного потока, а также доктору Линн Паддингтон из отделения иммунологии UConn Health за ее поддержку инструментов. Мы выражаем благодарность доктору Женеве Харгис из Медицинской школы Университета Коннектикута за ее помощь в написании и редактировании этой рукописи. Это исследование было поддержано грантами Национального института здравоохранения, Национального института сердца, легких и крови (R01HL145454), Национального института общих медицинских наук (R35GM147713 и P20GM139763), стартап-фонда UConn Health и стипендии Американской ассоциации иммунологов.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image