Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella bioenergetica cellulare, che genera adenosina trifosfato (ATP) mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Oltre a questo, il ruolo dei mitocondri si estende alla generazione e alla disintossicazione delle specie reattive dell’ossigeno, alla regolazione del calcio della matrice citoplasmatica e mitocondriale, alla sintesi cellulare, al catabolismo e al trasporto di metaboliti all’interno della cellula¹. La respirazione mitocondriale è essenziale in tutte le cellule, poiché la loro disfunzione può causare problemi metabolici 2, comprese le malattie cardiovascolari³ e un’ampia varietà di malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all’età⁴, il morbo di Parkinson e l’Alzheimer⁵ e la malattia di Charcot-Marie-Tooth² A (CMT2A)⁶.

Studi al microscopio elettronico sui neutrofili hanno rivelato che ci sono relativamente pochi mitocondri⁷ e fanno molto affidamento sulla glicolisi per la loro produzione di energia poiché i tassi di respirazione mitocondriale sono molto bassi⁸. Tuttavia, i mitocondri sono cruciali per le funzioni dei neutrofili, come la chemiotassi⁹ e l’apoptosi^10,11,12. Uno studio precedente ha rivelato una complessa rete mitocondriale nei neutrofili umani con alto potenziale di membrana. La perdita di potenziale della membrana mitocondriale è un indicatore precoce dell’apoptosi dei neutrofili¹⁰. Il trattamento con disaccoppiatore mitocondriale cianuro di carbonile m-clorofenil idrazono (CCCP) ha mostrato una significativa inibizione della chemiotassi, insieme a un cambiamento nella morfologia mitocondriale ^9,10.

Sebbene la fonte primaria di energia per i neutrofili sia la glicolisi, i mitocondri forniscono l’ATP che avvia l’attivazione dei neutrofili alimentando la prima fase della segnalazione purinergica, che aumenta la segnalazione Ca²⁺, amplifica la produzione di ATP mitocondriale e avvia le risposte funzionali dei neutrofili¹³. La disfunzione della catena respiratoria mitocondriale provoca un’eccessiva produzione di specie tossiche reattive dell’ossigeno (ROS) e porta a danni patogeni^14,15,16. La NETosi, che è il processo di formazione di trappole extracellulari di neutrofili (NET), è una proprietà critica dei neutrofili che li aiuta a combattere contro i patogeni¹⁷ e contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui cancro, trombosi e disturbi autoimmuni¹⁸. I ROS di derivazione mitocondriale contribuiscono alla NETosi¹⁹, il DNA mitocondriale può essere un componente di NETs¹⁸ e l’omeostasi mitocondriale alterata compromette NETosis 20,21,22,23,24. Inoltre, durante la normale differenziazione o maturazione, la riprogrammazione metabolica dei neutrofili viene invertita limitando l’attività glicolitica, e si impegnano nella respirazione mitocondriale e mobilitano i lipidi intracellulari^25,26.

L’analizzatore del flusso metabolico extracellulare può monitorare e quantificare continuamente la respirazione mitocondriale e la glicolisi delle cellule vive. L’analizzatore utilizza una cartuccia sensore a 96 pozzetti e due fluorofori per quantificare la concentrazione di ossigeno (O₂) e le variazioni di pH. La cartuccia del sensore si trova sopra il monostrato cellulare durante il test e forma una microcamera alta ~ 200 nm. I fasci di fibre ottiche nell’analizzatore vengono utilizzati per eccitare i fluorofori e rilevare le variazioni di intensità fluorescente. Le variazioni in tempo reale della concentrazione di O₂ e del pH vengono calcolate automaticamente e mostrate come tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Ci sono quattro porte sulla cartuccia del sensore che consentono di caricare fino a quattro composti in ciascun pozzetto durante le misurazioni del test. Questo protocollo si concentra sulla quantificazione della respirazione mitocondriale dei neutrofili di topo e umani, nonché delle cellule HL60 simili ai neutrofili, utilizzando l’analizzatore del flusso extracellulare metabolico.