Questo protocollo consente di rivelare l’impatto dei profagi sui loro ospiti. Le colture batteriche sono sincronizzate utilizzando le condizioni che meglio supportano lo stato lisogenico, limitando l’induzione spontanea. La RT-qPCR distingue inequivocabilmente i geni ristretti dai profagi e quelli disaccoppiati dal controllo fagico da quelli espressi durante il ciclo di replicazione litica.
I fagi temperati si trovano integrati come profagi nella maggior parte dei genomi batterici. Alcuni profagi sono criptici e fissati nel cromosoma batterico, ma altri sono attivi e possono essere innescati in una forma replicativa spontaneamente o per esposizione a fattori induttori. I profagi sono comunemente associati alla capacità di conferire la produzione di tossine o altri tratti associati alla virulenza sulla loro cellula ospite. Studi più recenti hanno dimostrato che possono svolgere un ruolo molto più importante nell’alterare la fisiologia dei loro ospiti. La tecnica qui descritta ci ha permesso di studiare come i profagi influenzano l’espressione genica nel batterio opportunista Pseudomonas aeruginosa.
In questo lavoro, la crescita del ceppo wild-type PAO1 di P. aeruginosa è stata confrontata con quella dei lisogeni isogenici che trasportano diverse combinazioni di profagi dal ceppo epidemico di Liverpool (LES) LESB58. In una coltura di lisogena, una parte delle cellule batteriche supporterà la replicazione dei batteriofagi litici (induzione spontanea) con un alto livello di espressione per cellula di geni fagici tardivi, come quelli associati all’assemblaggio di particelle fagiche, mascherando così l’espressione genica di basso livello associata all’espressione genica ristretta al lisogeno. L’impatto dell’induzione spontanea può quindi oscurare l’espressione genica dei profagi in una popolazione lisogena.
Gli esperimenti di profilazione della crescita sono stati utilizzati per identificare l’induzione spontanea, che era minima durante la prima fase di crescita esponenziale. Questo studio illustra come preparare le colture campione durante la fase iniziale di crescita esponenziale e come impostare controlli adeguati nonostante il basso numero di cellule. Questi protocolli garantiscono il confronto affidabile e riproducibile di batteri wild-type e lisogeni in varie condizioni, migliorando così il profilo trascrittomico dei genomi dei profagi e aiutando nell’identificazione di funzioni profagiche precedentemente non riconosciute.
Recentemente, la terapia fagica per affrontare la resistenza antimicrobica1 e l’editing genetico basato su CRISPR-Cas2 hanno generato un rinnovato interesse per la ricerca sui batteriofagi. Ancora una volta, i progressi della biotecnologia hanno permesso di studiare più a fondo le interazioni tra batteri e fagi3. Tuttavia, l’uso terapeutico dei fagi (“terapia fagica”) è ostacolato dalle preoccupazioni sui fagi che agiscono come elementi genetici mobili con la capacità di trasferire orizzontalmente geni di virulenza e resistenza4. La distesa di “materia oscura”5 (geni con funzioni sconosciute) è sia preoccupante che allettante. La materia oscura è considerata una lacuna nella nostra comprensione della biologia dei fagi e una risorsa in gran parte non sfruttata per gli strumenti molecolari e le potenziali nuove terapie. Lo sviluppo di tecniche di sequenziamento ad alto rendimento, insieme a una migliore annotazione genica 7,8,9 e a nuovi algoritmi di ripiegamento peptidico10, sta migliorando il rilevamento, la descrizione e la predizione funzionale dei geni fagici. Tuttavia, la scienza è ancora lontana dal convalidare le funzioni genetiche della maggior parte dei fagi in coltura o nel mondo reale.
Il sequenziamento dell’RNA (RNA-Seq) è in grado di mappare globalmente l’espressione genica durante l’infezione fagica e ha migliorato significativamente la comprensione degli elementi fagici e batterici coinvolti nei cicli litici e lisogenici11,12. Durante i processi lisogenici, i genomi dei fagi temperati vengono integrati nel DNA batterico per diventare profagi13. Gli esperimenti di profilazione dell’espressione genica globale possono essere utilizzati per identificare i geni ristretti dai profagi che sono codificati sui genomi dei fagi temperati ma espressi solo durante lo stato lisogenico11. Tali geni non codificano proteine strutturali dei fagi e non sono coinvolti in alcun processo di infezione dei fagi. RNA-Seq può essere utilizzato per identificare quei geni che hanno maggiori probabilità di influenzare la biologia dell’ospite batterico, inducendo un guadagno di funzione o regolando i geni batterici esistenti, consentendo così spesso ai batteri di adattarsi ai cambiamenti ambientali. Pertanto, potrebbe essere studiata la capacità dei profagi di agire come burattinai microbici, controllando una serie di funzioni batteriche.
Ci sono due principali ostacoli all’analisi efficace dell’espressione genica limitata ai profagi. In primo luogo, la disponibilità di host suscettibili è una questione chiave. Per definizione, i profagi sono già incorporati nel loro genoma specifico dell’ospite, quindi è difficile trovare un ospite wild-type suscettibile per confrontare l’espressione genica globale in presenza e in assenza del profago. Ciò può essere ottenuto attraverso l’infezione de novo di un altro ospite suscettibile o la delezione del profago dall’isolato wild-type originale, senza interrompere il resto del genoma dell’ospite. La seconda barriera risiede nella natura eterogenea delle popolazioni lisogeniche. Alcuni profagi si degradano attraverso la mutazione o la ricombinazione per diventare “criptici”, il che significa che sono fissati in una posizione specifica del genoma batterico. Tuttavia, altri profagi sono “attivi” e possono essere indotti in un ciclo litico replicativo spontaneamente o dopo l’esposizione a fattori induttori. In molte colture lisogeniche, il tasso di induzione spontanea significa che una parte delle cellule batteriche è sempre sottoposta a replicazione fagica litica14,15,16. Un alto livello di espressione dei geni fagici tardivi in queste popolazioni maschera l’espressione genica di basso livello associata all’espressione genica ristretta al lisogeno11,17. La proporzione di lisogeni sottoposti a induzione spontanea dei profagi può variare in base allo stato di crescita, alle condizioni di crescita o ad altri fattori scatenanti. Pertanto, per studiare gli impatti dei profagi sul lisosogeno, gli eventi spontanei di induzione dei profagi devono essere minimizzati il più possibile ottimizzando le condizioni di crescita per favorire lo stato lisogenico.
Questo studio riporta il lavoro preparatorio svolto per studiare l’influenza di una serie di profagi conviventi del ceppo epidemico di Liverpool (LES) di Pseudomonas aeruginosa. I profagi attivi sono stati indotti e isolati da LES e utilizzati per infettare il ceppo ospite modello di P. aeruginosa, PAO116,18,19. L’intero genoma del ceppo wild-type di P. aeruginosa, PAO1, e del suo lisosogeno, PAO1Φ2, è stato sequenziato (ad una profondità di copertura 30x) per garantire l’identità del ceppo wild-type e per confermare che il lisogeno era isogenico. Il LES è stato associato ad un aumento della morbilità e della mortalità nei pazienti con fibrosi cistica e i fagi LES 19 sono stati suggeriti per aiutare l’adattamento all’ambiente polmonare della fibrosi cistica16,19,20. Nonostante la forte evidenza che questi profagi influenzano la biologia del loro ospite20,21, la maggior parte delle loro funzioni geniche devono ancora essere caratterizzate e i meccanismi specifici di interazione sono poco compresi. Un approccio trascrittomico può scoprire empiricamente le funzioni del gene profago in un contesto ospite controllato. Poiché l’induzione spontanea può influenzare i profili di espressione, questo articolo descrive come ottimizzare le condizioni di crescita per favorire lo stato lisogenico. Tale sincronizzazione delle colture può essere convalidata mediante PCR in tempo reale per quantificare i livelli di espressione di marcatori genetici chiave associati a fasi cruciali della replicazione dei fagi LES in PAO1. Lo stesso approccio è stato utilizzato in precedenza per identificare le funzioni profagiche dei fagi tossigeni Shiga che influenzano la motilità, la resistenza agli acidi e la resistenza antimicrobica in Escherichia coli11,17,21,22.
La creazione di un ospite indicatore selezionabile, precedentemente utilizzato nei saggi di placca per quantificare in modo più accurato l’induzione spontanea del fago Stx da E. coli MC1061 37,38,39, è stata descritta qui per il fago LESΦ2 di P. aeruginosa. Questo intervento ha l’ulteriore vantaggio di ridurre le fasi e i tempi di elaborazione del campione, consentendo così la valutazione simultanea dei tassi di induzione spontanea in più condizioni di coltura. C’è il rischio di generare altre mutazioni durante la creazione di varianti resistenti alla rifampicina40; Tuttavia, in questo lavoro, il ceppo evoluto è stato utilizzato solo come ospite indicatore per l’enumerazione di placche da colture di interesse e non è stato incluso nell’analisi trascrittomica. Finché il ceppo indicatore selezionabile rimane ugualmente suscettibile all’infezione da parte del fago di interesse, non c’è preoccupazione per altre mutazioni acquisite. Ciononostante, non sono state rilevate differenze nei profili di polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione mediante l’analisi dell’elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) di PAO1WT e PAO1RIF (dati non mostrati).
Quando si scelgono le cellule ospiti, è raro trovare un ceppo indicatore che non ospiti già profagi. Ad esempio, PAO1 ospita il profago filamentoso Pf4. I controlli sperimentali per questo studio sono stati progettati per essere in grado di esaminare direttamente l’espressione genica di fagi specifici (in questo caso, il profago LES 2) e gli effetti che questo fago ha sull’espressione genica batterica. Nel confronto dei trascritti di PAO1 portatori del profago LES 2 e mancanti del profago LES 2 (sia il lisogeno che il non lisogeno portano il Pf4 endogeno), che fungono da controlli interni per escludere l’impatto di Pf4 sull’ospite. Inoltre, è stato dimostrato che Pf4 di solito non causa lisi nella sua cellula ospite41 e non è, quindi, in grado di confondere i risultati di questi esperimenti.
È assodato che un attento controllo di qualità è fondamentale nella preparazione dei campioni per produrre dati omici significativi42. Tuttavia, come descritto in precedenza11, l’attenta caratterizzazione dell’attività dei profagi nella preparazione di colture di lisogeni per tali studi viene eseguita raramente. Qui, descriviamo in dettaglio i nostri protocolli sistematici per la preparazione di un set di colture ben controllato e ottimizzato per gli studi trascrittomici per esplorare meglio le interazioni tra batteri e fagi temperati. La sincronicità della popolazione è stata controllata sottoponendo la coltura ad almeno quattro raddoppiamenti prima di trattarla con l’antibiotico induttore norfloxacina. Determinando la MIC di norfloxacina per il ceppo nello studio, abbiamo potuto garantire che la concentrazione dell’agente induttore fosse appena al di sopra della MIC per il trattamento di “induzione”. Le cellule trattate sono state quindi diluite 1:10 per abbassare la concentrazione di norfloxacina al di sotto della MIC dopo il trattamento di 1 ora al fine di consentire alle cellule di recuperare e completare il processo di replicazione dei fagi, terminando con la lisi della cellula e il rilascio della progenie fagica infettiva. Le cellule entrano nel ciclo di replicazione litica dopo lo stimolo di induzione solo una volta che la concentrazione di norfloxacina è stata portata al di sotto della MIC durante il periodo di recupero. In questo caso, superare 1 μg·mL−1 di norfloxacina significa che il farmaco non può essere efficacemente diluito al di sotto del MIC, poiché la MIC per la norfloxacina per PAO1 è di 0,19 μg·mL−1. Il livello di diluizione dell’induttore deve essere bilanciato con la necessità di recupero del lisogeno e il mantenimento della densità di coltura per la raccolta dell’RNA. I dati qui discussi dimostrano che è possibile sincronizzare le colture per creare campioni in cui domina la lisogenia, riducendo così il rumore dell’induzione spontanea e consentendo il rilevamento di veri cambiamenti guidati dalla lisogenia nell’espressione genica. Poiché lo stato lisogenico è predominante nella fase esponenziale iniziale della crescita, quando la densità cellulare batterica è bassa, suggeriamo di aumentare le colture per raccogliere abbastanza RNA per i successivi studi di espressione genica come RNA-Seq.
L’uso della norfloxacina come agente induttore per forzare le colture nel ciclo litico è ben segnalato43,44; Tuttavia, questo influenzerà anche l’espressione di altri geni batterici nel processo45,46. Per mitigare questo problema, le librerie di RNA provenienti da colture wild-type di controllo coltivate nelle stesse condizioni di induzione e non induzione dovrebbero essere incluse negli esperimenti di RNA-Seq. Anche l’uso di controlli interni e geni marcatori chiave per convalidare le fasi della replicazione dei fagi mediante qRT-PCR è fondamentale per confronti accurati. La profilazione quantitativa della RT-PCR non può essere interpretata confrontando il numero assoluto di trascritti per ciascun gene in vari punti temporali; È la forma del profilo che conta. In primo luogo, è stata campionata solo una piccola regione nel trascritto per qualsiasi gene, quindi nonsi sa se si tratti di un elemento di breve o più lunga durata. Certamente, la mappatura RNA-Seq dei trascritti mostra che la densità dei dati di mappatura varia significativamente sulla lunghezza di un gene. In secondo luogo, è la forma del profilo di espressione genica che dovrebbe essere interpretata per un gene marcatore associato al ciclo litico o allo stile di vita lisogenico o addirittura disaccoppiato dai circuiti regolatori fagici11. L’induzione spontanea è un problema reale nella coltura del lisogeno e si tradurrà sempre nell’espressione di geni associati al ciclo litico. Tuttavia, la profilazione mostra che i geni associati al ciclo di replicazione litica sono soppressi nella loro pre-induzione di espressione (almeno due pieghe logaritmiche) e post-induzione up-regolata.
Le analisi trascrittomiche condotte in precedenza sulle interazioni dei fagi Stx con E. coli supportano una comprensione approfondita dei geni fagici coinvolti nel mantenimento della lisogenia e nell’innesco del ciclo litico11,17. Attualmente, i fagi LES di P. aeruginosa sono stati annotati, ma le loro funzioni geniche chiave sono meno ben comprese. Gli studi trascrittomici consentiranno la ri-annotazione dei profagi LES e miglioreranno la nostra comprensione dei geni coinvolti nella lisogenia e nel ciclo litico. Collegare la sequenza genica alla funzione rappresenta una sfida importante nello studio di nuovi profagi, il che evidenzia ulteriormente la necessità di ulteriori studi per confermare le funzioni del gene fago per la produzione di migliori strumenti di annotazione47. L’applicazione e l’adattamento più ampi dei protocolli e delle misure di controllo della qualità aggiuntive descritte in questo articolo video potrebbero aiutare a svelare varie funzioni dei profagi e, quindi, a migliorare le pipeline di annotazione e a trasformare la nostra comprensione della biologia dei fagi e dei batteri.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |